HQ 6 ENZIMAS 2

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identificación histoquímica de enzimas Profesora: Jimena Le Roy Carrera Tecnología Médica Universidad de Valparaíso

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INCUBACIÓN Material de vidrio lavado químicamente Incubación a 37º Lavados en suero fisiológico o buffer Mantener el pH indicado Incubar siempre varias placas Utilice placa control

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CONTROLES Inactivando la enzima por medio del calor Suprimiendo algún compuesto fundamental Agregar a la incubación un inhibidor específico

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TRATAMIENTO DEL TEJIDO BREVE FIJACIÓN PREVIA AL CORTE POST FIJACIÓN DESPUES DE LA INCLUSIÓN FIJACIÓN E INCLUSIÓN EN PARAFINA

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Las enzimas catalizadoras de reacciones de óxido reducción son reveladas por medio de sustratos que contienen sales de tetrazolio dando compuestos altamente coloreados , formazanes EZ. ÓXIDO REDUCTASAS EZ. HIDROLÍTICAS Son difíciles de dar productos coloreados necesitan en el medio de incubación un compuesto que aumente su precipitación a una forma insoluble

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EZ. ÓXIDO REDUCTASAS Fe +2 oxidación Fe +3 Sustrato + aceptor Sustrato oxidado + aceptor reducido enzima

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EZ. ÓXIDO REDUCTASAS DESHIDROGENASAS La enzima es detectada por un aceptador artificial de electrones Se reconce por una sal de Tetrazolio, que acepta electrones reduciéndose a formazan Utilizan un aceptor intermediario de electrones, coenzima o acelerador Las dehidrogenasas no resisten fijación

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DESHIDROGENASAS SALES DE TETRAZOLIO Cloruro de Neotetrazolio NT Azul de tetrazolio BT Yodo nitrotetrazolio YNT Compuestos haterocíclicos Son estables Se recomiendan las diformazanes Que sean puras No se reducen fácilmente por la luz Insolubles en lípidos u otras proteínas

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Diaphorasas ( mitocondrias) NADPH la coenzima NADH o NADPH es el sustrato La sal de tetrazolio el aceptor Se reconoce la enzima diaforasa en el lugar Coenzima reducida + NBT coenzima oxidada + formazán

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oxidasas Catalizan la oxidación de : Coenzimas Ácidos grasos Amino ácidos Citocromos etc Catalizan la transferencia de O2 desde el peróxido de hidrógeno a un aceptor Enzimas de la cadena respiratoria Poseen Fe que pasa del estado oxidado al reducido Se encuentran en las mitocondrias

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Su identificación se basa en su acción catalizadora sobre otra sustancia Benzidina + H2O2 producto coloreado peroxidasa peroxidasas

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FOSFATASA ALCALINA Se reconoce por el método de Gomori Permite la fijación corta en formol a 4ºC pH óptimo es de 8,6 El buffer usado no debe contener fosfato ENZIMAS HIDROLÍTICAS identificables por métodos H.Q. E.C. 3.1.3.1

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Anión carbonato: fosfatasa alcalina Ion fosfato liberado capturado por Ca fosfato de Calcio nitrato de cobalto fosfato de cobalto sulfuro de cobalto ENZIMAS HIDROLÍTICAS identificables por métodos H.Q.

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FOSFATASA ÁCIDA Monoesterasa hidroliza los monoésteres del ácido fosfórico su pH óptimo es de 4,5 – 5 Permite una prefijación corta en formol a 4ºC Método de Gomori La formalina inhibe la reacción de fosfatasa en riñón e hígado Usa el mismo principio anterior con otro pH ENZIMAS HIDROLÍTICAS identificables por métodos H.Q. Enzimas lisosomales

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Anión carbonato: fosfatasa alcalina Ion fosfato liberado capturado por Pb ( nitrato de Pb) fosfato de plomo glicerofosfato de amonio o amnio sulfuro de amonio

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Compuesto naftólico soluble : fosfatasa ácida sulfatasas B-glucoronidasa glucosidasas Naftol liberado ésteres de naftol(sustrato) B naftol sal de diazonio colorante azoico

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PATOLOGÍAS IDENTIFICABLES CON MÉTODOS ENZIMÁTICOS Glomérulo nefritis 5 núcleotidasa glomerular (hidrolìtica) Necrosis tubular ausencia o gran disminución de la deshidrogenasa succínica Leucemia mielocítica + para peroxidasa Leucemia mieloblástica - para peroxidasa Enfermedad de Hirschsprung +++aceticolinoesterasa

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Diagnóstico de TUMORES Metástasis prostática + para fosfatasa ácida - para tartrato de sodio Sarcomas - para Beta glucoronidasa Carcinomas + + para beta glucoronidasa Sarcoma de Edwing ++ para fosfatasa alcalina

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Hepatoma - para fosfatasa alcalina en sinusoides y canalículos + para fosfatasa alcalina en céls neoplásicas Tumores epiteliales Adenoca. De Colon Estómago + para aminopeptidasa Melanomas meningomas Melanoma juvenil Melanoma maligno Para tirosinasa + para tirosinas

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Musculatura estriada fibras tipo I de baja actividad enzimática para ATP asa Alta actividad para SDH Fibras tipo II intensa reacción para ATPasa intensa actividad para fosforilasa

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SDH

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ATPasa

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Localización histoquímica de la enzima Mg- ATPasa en la membrana basolateral de células epiteliales gástricas.