ELISA

TEHNICA IMUNOENZIMATICA: 

TEHNICA IMUNOENZIMATICA

CE ESTE TEHNICA IMUNOENZIMATICA?: 

CE ESTE TEHNICA IMUNOENZIMATICA? ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent Assay Metoda de detectare a unor molecule (proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul complexelor antigen-anticorp conjugate cu o enzima Foarte sensibila (pg/ml) Cantitativa sau calitativa Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime

PowerPoint Presentation: 

PRODUCEREA ANTICORPILOR MONOCLONALI Plasmocite producatoare de Ac Antigen Fuzionarea celulelor  HIBRIDOM Mielom Anticorpii monoclonali sunt purificati Clonele dorite se cultiva sau se congeleaza Testarea clonelor Hibridoamele se separa si se cultiva Cultivarea hibridoamelor Mentinerea hibridoamelor in soareci

ENZIMELE: 

ENZIMELE Enzime= catalizator i biochimic i , compusi care maresc viteza reactiilor chimice ce se desfasoara in sistemele biologice, fara sa se consume in cursul lor Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima Enzime utilizate: Peroxidaza Fosfataza alcalina Glucozoxidaza G6PH

ENZIMELE: 

ENZIMELE Substraturi: substante cromogene, care formeaza produsi de reactie colorati (cromofore) Enzima + substrat  cromofor  citire la spectrofotometru

PROBE BIOLOGICE: 

PROBE BIOLOGICE Ser Plasma Urina Scaun Lichid sinovial LCR Lichid de lavaj bronsic

PLACA PENTRU ELISA: 

PLACA PENTRU ELISA 96 godeuri Plastic pe care adera usor proteinele

TIPURI DE ELISA: 

TIPURI DE ELISA ELISA necompetitiva “sandwich” ELISA competititiva ELISA indirecta (dozarea Ac)

ELISA “SANDWICH”: 

ELISA “SANDWICH” Ag trebuie sa prezinte ≥2 epitopi (identici sau diferiti ) Ac primar (Ac 1 ): Imobilizat in faza solida in godeurile placii Nemarcat enzimatic Ac secundar (Ac 2 ): Marcat enzimatic

ELISA “SANDWICH”: 

ELISA “SANDWICH” Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu Ac 1 fixat Se incubeaza  complexe Ag-Ac 1 Se spala excesul de Ag (Ag liber) Se pipeteaza Ac 2 (marcat enzimatic) Se incubeaza  complexe Ac 1 -Ag-Ac 2 Se spala excesul de Ac 2 (Ac 2 liber) Se adauga substratul  colorarea mediului de reactie ~ cantitatea de Ag din proba Se citeste la spectrofotometru

ELISA “SANDWICH”: 

ELISA “SANDWICH”

ELISA COMPETITIVA: 

ELISA COMPETITIVA Ac primar (Ac 1 ): Specific pentru Ag de determinat Nemarcat enzimatic Ac secundar (Ac 2 ): Specific pentru Fc al Ac 1 Marcat enzimatic

ELISA COMPETITIVA: 

ELISA COMPETITIVA Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate cunoscuta de Ac 1 , in solutie Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag fixat 2 situatii: Exces de Ag Exces de Ac 1

ELISA COMPETITIVA: 

ELISA COMPETITIVA Exces de Ag: Solutie (cu Ag) + Ac 1  Ag- Ac 1 + Ag libere Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)  nu se formeaza complexe Ag- Ac 1 fixe Se spala Ag-Ac 1 libere si Ag libere Se pipeteaza Ac 2 in godeuri  nu se formeaza complexe Ag- Ac 1 - Ac 2 fixe Se spala Ac 2 liber (tot Ac 2 , de fapt) Se adauga substratul  nu apare nicio reactie  incolor

ELISA COMPETITIVA: 

ELISA COMPETITIVA Exces de Ac 1 : Solutie (cu Ag) + Ac 1  Ag- Ac 1 + Ac 1 liberi Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)  complexe Ag- Ac 1 fixe Se spala Ag- Ac 1 libere Se pipeteaza Ac 2 in godeuri  complexe Ag- Ac 1 - Ac 2 fixe Se spala Ac 2 liber Se adauga substratul  colorarea mediului de reactie i.p. cantitatea de Ag din proba Se citeste la spectrofotometru

ELISA COMPETITIVA: 

ELISA COMPETITIVA

ELISA INDIRECTA: 

ELISA INDIRECTA Dozarea Ac Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat Ac primar (Ac 1 ): =Ac de determinat Nemarcat enzimatic Ac secundar (Ac 2 ): Specific pentru Fc al Ac 1 Marcat enzimatic

ELISA INDIRECTA: 

ELISA INDIRECTA Se pipeteaza proba (cu Ac 1 ) in godeurile cu Ag fixat Se incubeaza  complexe Ag- Ac 1 fixe Se spala Ac 1 liber Se pipeteaza Ac 2 Se incubeaza  complexe Ag- Ac 1 - Ac 2 fixe Se spala Ac 2 liber Se adauga substratul  colorarea mediului de reactie ~ cantitatea de Ac 1 din proba Se citeste la spectrofotometru

ELISA INDIRECTA: 

ELISA INDIRECTA

ELISA: 

ELISA

AVANTAJE: 

AVANTAJE Sensibila Reproductibila Cantitati mici de reactivi (ieftina) Determina si Ag, si Ac Automata (rapida) Noniradianta

APLICATII: 

APLICATII Hormoni Markeri tumorali Droguri, medicamente Citokine Ag virale ( HIV !), bacteriene, parazitare Ac ( HIV! )

TEST HIV: 

TEST HIV

TEST DE SARCINA: 

TEST DE SARCINA