Unidad 14: Biología Molecular :Unidad 14: Biología Molecular Dr. Jesús Rafael Cedeño M. Profesor Instructor Actualización: febrero 2008


Contenido Programático :Contenido Programático Generalidades de Ácidos Nucleicos Función, estructura, propiedades Metabolismo del ADN Replicación, mutaciones, reparación Metabolismo del ARN Transcripción, maduración Síntesis de proteínas Bibliografía recomendada: Nelson & Cox: Lehninger. Principios de Bioquímica, 4ª edición. (capítulos 8, 24, 25, 26 y 27)


Parte 1: Generalidades :Parte 1: Generalidades Aspectos históricos, estructura general del ADN y el ARN


El ADN como repositorio de información :El ADN como repositorio de información Wilhelm Hofmeister 1848: Cromosomas Friedrich Miescher 1869: Nucleína Sospecha papel en la herencia Error: Nucleína es molécula pequeña, no apta para papel. Frederick Griffith Ejército británico. Búsqueda de vacuna contra neumococo 1928. Transformación bacteriana Dudas sobre sustancia que generaba transformación Avery, MacLeod, McCarty 1944. ADN almacena información Dudas sobre pureza Hershey y Chase 1952. Confirman ADN como almacén de información Erwin Chargaff Finales de los ‘40 A=T, G=C ó A+G=T+C Franklin y Wilkins Difracción de Rayos X ADN es hélice con dos periodos Watson y Crick 1953. Estructura 3D del ADN


Miescher y Levene :Miescher y Levene


Transformación bacteriana:Griffith y Avery, MacLeod y McCarty :Transformación bacteriana:Griffith y Avery, MacLeod y McCarty


El Experimento de Hershey y Chase :El Experimento de Hershey y Chase


Los trabajos de Franklin y Wilkins :Los trabajos de Franklin y Wilkins


El modelo de Watson y Crick :El modelo de Watson y Crick


El Modelo de Watson y Crick :El Modelo de Watson y Crick


Polimerización de Nucleótidos :Polimerización de Nucleótidos


El Modelo de Watson y Crick :El Modelo de Watson y Crick


Enlazando las cadenas :Enlazando las cadenas


El Modelo de Watson y Crick sugiere un mecanismo para la duplicación :El Modelo de Watson y Crick sugiere un mecanismo para la duplicación


Otras formas del ADN :Otras formas del ADN


Propiedades del ADN A, B y Z :Propiedades del ADN A, B y Z


Palíndromos e Imágenes en Espejo :Palíndromos e Imágenes en Espejo


Horquillas y Cruciformes :Horquillas y Cruciformes


Apareamientos de Hoogsten :Apareamientos de Hoogsten


ADN-H :ADN-H


Estructura del ARN :Estructura del ARN


Formas 3D complejas en ARN :Formas 3D complejas en ARN


Parte 2: Estructura del Genoma :Parte 2: Estructura del Genoma Cromosomas y sus elementos, elementos de los genes eucariontes, enrollamiento y compactación del ADN


ADN y Cromosomas :ADN y Cromosomas ADN: altamente especializado Sólo una función conocida Única molécula con mecanismos de reparación Molécula de gran tamaño Genoma de S. cerevisiae: más de 1.500.000 pb Henoma humano: más de 280.000.000 pb Una molécula de ADN es más larga que la célula Altamente compactada Compactación ordenada Formación de cromosomas


Trabajo de Beadle y Tatum :Trabajo de Beadle y Tatum


Elementos Cromosómicos :Elementos Cromosómicos Genes Definición clásica: “parte de un cromosoma que determina o afecta un caracter único del fenotipo” Beadle y Tatum, 1940: un gen – una enzima Moderna: Segmento de ADN que codifica la secuencia primaria de un producto génico final, sea polipéptido o ARN con función estructural o catalítica. Secuencias Regulatorias Otras secuencias no codificantes


Complejidad del Genoma Eucariota :Complejidad del Genoma Eucariota Más de un cromosoma Genoma más largo Presencia de interrupciones Secuencias de ADN no codificante entre genes y dentro de los genes Intrones y Exones 30% del genoma humano está en los genes: sólo 1,5% codifica realmente Varios tipos de secuencias no codificantes Altamente repetitivo (SSR): centrómeros y telómeros


Roy Britten y David Kohne: secuencias no codificantes en el ADN :Roy Britten y David Kohne: secuencias no codificantes en el ADN


Intrones y Exones :Intrones y Exones


Centrómeros y Telómeros :Centrómeros y Telómeros


Tipos de Secuencia en el Genoma Humano :Tipos de Secuencia en el Genoma Humano


La Longitud del Genoma :La Longitud del Genoma


Superenrollamiento del ADN :Superenrollamiento del ADN “Enrollar un rollo” ADN es doble hélice; enrollarlo es superenrrollar Generalmente producto de tensión estructural Si el eje no está doblado, se dice que el ADN está “relajado” Hay que desenrollarlo para leerlo


Dos clases de superenrrollamiento :Dos clases de superenrrollamiento


Cromosoma :Cromosoma Dos significados Funcional: molécula de ácido nucleico que almacena la información genética de un organismo Morfológica: cuerpos teñidos que se observan en el núcleo de una célula eucariótica bajo el microscopio de luz. Estructura varía según fase del ciclo celular Cromatina: material amorfo, con aparente dispersión aleatoria y desorganizada Cromatina: complejo de ADN y proteínas Histonas Nucleosomas Proteínas no-histonas


Cambios en la cromatina durante el Ciclo Celular :Cambios en la cromatina durante el Ciclo Celular


Nucleosomas: unidad estructural básica :Nucleosomas: unidad estructural básica


Núcleo de Histonas del Nucleosoma :Núcleo de Histonas del Nucleosoma


Otros Niveles de Compactación :Otros Niveles de Compactación Formación de nucleosomas compacta ADN hasta 1/7 Compactación real es mas de 1/10,000 Mayores niveles de compactación Fibra de 30 nm Depende de interacciones entre H1 Compactación dee 1/100 Niveles superiores de compactación Aún no completamente elucidados Aparente participación de “proteína de andamiaje nuclear”


Fibra de 30 nm y Modelo de Andamiaje :Fibra de 30 nm y Modelo de Andamiaje


Modelo para niveles superiores de compactación :Modelo para niveles superiores de compactación


Parte 3: Metabolismo del ADN :Parte 3: Metabolismo del ADN Replicación, Mutaciones, Mecanismos de Reparación


Metabolismo del ADN :Metabolismo del ADN Varios procesos complejos Replicación Reparación Recombinación Requisito principal: Precisión Mecanismo de síntesis sencillo Complejidad necesaria para asegurar fidelidad Errores pueden tener consecuencias graves ADN única molécula con mecanismos de reparación


Fundamentos de la Replicación :Fundamentos de la Replicación Requiere de un molde o patrón Cada cadena sirve como molde para la complementaria Semiconservativa Inicio en orígenes específicos y bidireccional Siempre ocurre en sentido 5’?3’ Lectura siempre en sentido 3’?5’ Semidiscontinua Una de las dos cadenas debe replicarse por fragmentos Requiere de un cebador (“primer”)


Formación de Horquillas de Replicación :Formación de Horquillas de Replicación


Definiendo términos en la Replicación :Definiendo términos en la Replicación


Síntesis de ADN: ADN Polimerasas :Síntesis de ADN: ADN Polimerasas Arthur Kornberg, 1955 ADN Polimerasa I Posteriormente, cuatro enzimas más Estudios cinéticos Luego de agregar un nucleótido a la cadena, la ADN polimerasa puede permanecer o disociarse. Reacción más rápida si no hay disociación Cantidad de nucleótidos unidos por una ADN polimerasa antes de disociarse es Procesividad ADN Polimerasa I tiene baja procesividad No es la principal enzima de la replicación


Fidelidad de Replicación en E. coli :Fidelidad de Replicación en E. coli En la replicación de E. coli hay un error cada 109-1010 nucleótidos Especificidad de apareamientos y precisión de ADN polimerasa I no es suficiente 104-105 Capacidad de corrección sobre la marcha “Verificación” Actividad 3'?5' exonucleasa Eleva precisión a 1 en 106-108 Precisión adicional depende de otras enzimas


Actividad 3’?5’ Exonucleasa :Actividad 3’?5’ Exonucleasa


Actividad 3’?5’ Exonucleasa :Actividad 3’?5’ Exonucleasa


ADN Polimerasas de E. coli :ADN Polimerasas de E. coli


Actividad 5’?3’ Exonucleasa :Actividad 5’?3’ Exonucleasa


Subunidades de la ADN Polimerasa III de E. coli :Subunidades de la ADN Polimerasa III de E. coli


ADN Polimerasa III de E. coli :ADN Polimerasa III de E. coli


Enzimas de la Replicación en E. coli :Enzimas de la Replicación en E. coli ADN Polimerasa III Enzima principal del proceso Helicasas Separan las dos cadenas del ADN Topoisomerasas Alivian la tensión producida por la separación de las dos cadenas SSB Estabilizan ADN monocatenario Primasas ADN ligasas


Visión General de la Replicación :Visión General de la Replicación


Proteínas de la Fase de Inicio de la Replicación :Proteínas de la Fase de Inicio de la Replicación


Inicio de la Replicación en E. coli :Inicio de la Replicación en E. coli


Elongación en E. coli (1) :Elongación en E. coli (1)


Elongación en E. coli (2) :Elongación en E. coli (2)


Elongación en E. coli (3) :Elongación en E. coli (3)


Elongación en E. coli (4) :Elongación en E. coli (4)


Elongación en E. coli (5) :Elongación en E. coli (5)


Animación del Replisoma :Animación del Replisoma


Proteínas de la Elongación :Proteínas de la Elongación


¡La Replicación es Bidireccional! :¡La Replicación es Bidireccional!


Fase de Terminación en E. coli :Fase de Terminación en E. coli


Replicación en Eucariotas :Replicación en Eucariotas Desplazamiento del replisoma es más lento en eucariotas Teóricamente, replicación de un cromosoma humano, 5000 horas Múltiples orígenes de replicación simultáneos (ARS o replicadores) Replicadores reconocidos por ORC, regulada por CDC6 y CDT1 Complejo ORC/CDC6/CDT1 ensambla heterohexámero de MCM2-MCM7 Helicasa (funciona como DnaB) CDC6 y CDT1 tienen función similar a DnaC


ADN Polimerasas Eucariotas :ADN Polimerasas Eucariotas Hay algunas con funciones muy específicas Replicación del ADN mitocondrial Replicación de cromosomas nucleares: ADN polimerasa a Actividad primasa No tiene actividad de verificación ADN polimerasa d Estimulada por PCNA (similar a subunidad ß de E. coli) Complejo similar a ADN polimerasa III ADN polimerasa e Aparentemente, rol similar a ADN polimerasa I Telomerasas


Mutaciones :Mutaciones


Reparaciones Automáticas en Algunas Mutaciones :Reparaciones Automáticas en Algunas Mutaciones


Sistemas de Reparación del ADN :Sistemas de Reparación del ADN


Parte 4: Metabolismo del ARN :Parte 4: Metabolismo del ARN Transcripción, Maduración del ARNm


Generalidades sobre el ARN :Generalidades sobre el ARN Molécula única Ácido nucleico monocatenario Función en información, estructura y catálisis Sintetizado a partir de información contenida en ADN Varias clases de ARN ARNm: información para la síntesis de proteínas ARNt: transporta aminoácidos al ribosoma ARNr: componente de ribosomas, función no clara ARNnh: precursor del ARNm ARNnp: función catalítica Otros con actividad catalítica


Replicación Vs Transcripción :Replicación Vs Transcripción Semejanzas Diferencias Mecanismo de reacción Sentido de lectura y síntesis Necesidad de un molde Fases de Inicio, Elongación y Terminación Utiliza NTP en lugar de dNTP Sólo se lee una cadena del ADN No requiere cebador Sólo se transcribe una parte de la molécula de ADN Uridilato en lugar de Timidilato


ARN Polimerasa ADN-Dependiente de E. coli :ARN Polimerasa ADN-Dependiente de E. coli


Inicio de la Transcripción :Inicio de la Transcripción Cada gen tiene un punto de inicio de transcripción Promotor En E. coli, promotores están cerca de posición -70 Reconocidos por subunidad s Fase de Inicio dividida en dos subfases Fase de Unión: formación del “complejo cerrado” Fase de Inicio: apertura del complejo cerrado e inicio de la elongación


Fase de Inicio :Fase de Inicio


Mecanismo de Terminación ?-Independiente :Mecanismo de Terminación ?-Independiente


ARN Polimerasas Eucariotas :ARN Polimerasas Eucariotas ARN Polimerasa I ARN pre-ribosómico precursor de ARNr 18S, 5,8S y 28S ARN Polimerasa II ARNm y algunos especializados ARN Polimerasa III ARNt, ARNr 5S y algunos especializados


Cofactores Proteicos de la ARN Polimerasa II :Cofactores Proteicos de la ARN Polimerasa II


Transcripción en Eucariotas :Transcripción en Eucariotas


Inhibidores de la Transcripción :Inhibidores de la Transcripción Actinomicina D Deforma el ADN al intercalares entre pares GC. Evita el desplazamiento de la polimerasa Rifampicina Inhibe la transcripción en procariotas. Une subunidad ß a-Amanitina Toxina de Amanita phalloides (“Ángel Destructor”) Inhibe ADN polimerasa II


Maduración del ARN :Maduración del ARN Resultado de la transcripción es Transcrito Primario ARNnh “Maduración” por varias modificaciones ARNt en todos los seres vivos ARNm en las células eucariotas ARNm eucariota Eliminación de intrones Empalme Capuchón 5’ Cola Poli A


Capuchón 5’ :Capuchón 5’


Empalme de Intrones Clase I :Empalme de Intrones Clase I


Cola Poli A :Cola Poli A


Resumen del Procesado Post-transcripción :Resumen del Procesado Post-transcripción


Otras Enzimas que Sintetizan Ácidos Nucleicos :Otras Enzimas que Sintetizan Ácidos Nucleicos Transcriptasa Inversa (retrotranscriptasa) Sintetiza ADN a partir de ARN Principalmente retrovirus Telomerasas son transcriptasas inversas eucarióticas ARN Replicasa Sintetiza ARN usando ARN como patrón Virus deben poseer la enzima en la cápside


Modificación al Dogma Central :Modificación al Dogma Central


Acción de la retrotranscriptasa: Replicación del HIV :Acción de la retrotranscriptasa: Replicación del HIV


Parte 5: Síntesis de Proteínas :Parte 5: Síntesis de Proteínas “Teoría del Adaptador”, Código Genético, Traducción


Traducción: Generalidades :Traducción: Generalidades Proteínas son los productos finales de la información Proteómica Uno de los procesos bioquímicos más complejos >70 proteínas ribosómicas >20 enzimas para activar aminoácidos Aprox. 12 proteínas como factores de inicio, elongación y terminación >100 enzimas para el procesado final de la proteína >40 clases de ARN >90% de la energía producida por una célula Rápido a pesar de su complejidad


ARN: Intermediario entre ARN y Proteínas :ARN: Intermediario entre ARN y Proteínas


Francis Crick: Hipótesis del “Adaptador” :Francis Crick: Hipótesis del “Adaptador”


Propiedades del Código Genético :Propiedades del Código Genético Cada aminoácido es codificado por un triplete (codón) La lectura de los codones es no-solapante Codón específico establece el Marco de Lectura No hay pausas o puntuaciones Hay codones de parada Casi universal No Ambiguo Degenerado La secuencia del codón es complementaria a la secuencia del anticodón en el ARNt


El Código Genético :El Código Genético


Degeneración del Código Genético :Degeneración del Código Genético


Hipótesis de la “Base Tambaleante” :Hipótesis de la “Base Tambaleante”


“Reglas de Tambaleo” :“Reglas de Tambaleo”


Etapas de la Síntesis de Proteínas :Etapas de la Síntesis de Proteínas Activación de Aminoácidos Reacción citosólica Unión del aminoácido al ARNt correspondiente Inicio Ensamblaje del ribosoma alrededor del ARNm Elongación Movimiento del ribosoma y formación de enlaces peptídicos Terminación Liberación del péptido y el ARNm del ribosoma Plegamiento y modificación post-traducción


ARN de Transferencia :ARN de Transferencia


Dos Clases de Aminoacil-ARNt Sintetasas :Dos Clases de Aminoacil-ARNt Sintetasas


Activación de Aminoácidos :Activación de Aminoácidos


Ribosomas :Ribosomas


Fase de Inicio: Paso 1 :Fase de Inicio: Paso 1


Fase de Inicio: Paso 2 :Fase de Inicio: Paso 2


Fase de Inicio: Paso 3 :Fase de Inicio: Paso 3


Fase de Inicio en Eucariotas :Fase de Inicio en Eucariotas


Elongación: Unión de aARNt :Elongación: Unión de aARNt


Elongación: Enlace Peptídico :Elongación: Enlace Peptídico


Elongación: Traslocación :Elongación: Traslocación


Fase de terminación en E. coli :Fase de terminación en E. coli


El Proceso de Traducción :El Proceso de Traducción


Traduciendo múltiples copias :Traduciendo múltiples copias


Procariotas: acoplan transcripción y traducción :Procariotas: acoplan transcripción y traducción


Inhibidores de la Sítesis de Proteínas :Inhibidores de la Sítesis de Proteínas Puromicina Semejanza al extremo 3' de Aminoacil-ARNt Participa en formación de enlace, y luego detiene la síntesis Tetraciclinas Bloquean el sitio A del ribosoma. No entra Aminoacil-ARNt Cloramfenicol Interfiere en la formación del enlace peptídico Cicloheximida Inhibe formación de enlace peptídico en eucariotas Estreptomicina Produce errores en la lectura del código


Síntesis de Proteínas: Una Épica a Nivel Celular :Síntesis de Proteínas: Una Épica a Nivel Celular Película realizada en 1971 en la Universidad de Stanford Dirigido por Prof. Robert Allan Weiss Introducción por Dr. Paul Berg Primer intento de representar procesos celulares mediante imágenes en movimiento Desactualizado, pero aún se muestra


Síntesis de Proteínas: Una Épica a Nivel Celular :Síntesis de Proteínas: Una Épica a Nivel Celular