Lecture 9 2009

Views:
 
Category: Entertainment
     
 

Presentation Description

No description available.

Comments

Presentation Transcript

Slide 1:

УРОВНИ УПАКОВКИ ДНК В ЯДРЕ ЭУКАРИOТИЧЕСКОЙ КЛЕТКИ Размер человеческой ДНК - 1 ,8 м Размер ядра - 10 мкм Степень упаковки - 4 0 000х

Slide 2:

ДНК НУКЛЕОСОМЫ ДОМЕНЫ ХРОМОСОМЫ

Slide 3:

Компактизация ДНК в ядре осуществляется при посредстве сложного комплекса белков, среди которых принято выделять гистоны и негистоновые белки Гистоны являются чрезвычайно консервативными белками. Выделяют 5 основных типов гистонов Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4 Гистоны Н2А, Н2В, Н3, Н4 входят в состав минимальной нуклеосомы (так называемой “Core Particle”) . По-этому их нередко называют «коровыми» гистонами

Slide 4:

линкерный гистон гистоны нуклеосомного ядра

К открытию нуклеосом привели две группы экспериментов: 1. Электронная микроскопия препаратов хроматина в низкой ионной силе 2. Анализ продуктов расщепления хроматина стафилококковой нуклеазой :

К открытию нуклеосом привели две группы экспериментов: 1. Электронная микроскопия препаратов хроматина в низкой ионной силе 2. Анализ продуктов расщепления хроматина стафилококковой нуклеазой

Slide 6:

Нуклеосома является базовой структурной единицей первого уровня упаковки ДНК в хроматине. Она представляет собой белковую глобулу, или, точнее говоря некое подобие диска, на который намотан фрагмент ДНК протяженностью 146 п.н. (1,65 витка ) Глобула состоит из восьми молекул гистонов: тетрамера (Н3) 2 -(Н4) 2 и двух димеров Н2А-Н2В. Диаметр глобулы-диска составляет ~11 нм, а высота - ~ 5,7 нм H1 связывается с ДНК, входящей на нуклеосому, и ДНК, выходящей из нуклеосомы, стабилизируя глобулу и обеспечивая замыкание двух полных витков ДНК

Slide 7:

Модульный принцип посторения нуклеосомнорго ядра отражает характер его сборки

Slide 9:

Бороздки в двух витках ДНК ориентированы параллельно. В этой связи остается Достаточно места для выхода «за пределы глобулы» хвостов гистонов Н3 и Н2В

Slide 10:

Гистоны контактируют с фосфодиэфирным остовом молекулы ДНК. Контакты реализуются через каждые 10 пар оснований, когда малая бороздка ДНК оказывается развернутой внутрь. В целом, накрученная на нуклеомную глобулу ДНК образует 14 прочных электростатических контактов с молекулами гистонов.

Slide 11:

N- концевые фрагменты гистонов выходят за пределы нуклеосомного ядра. На них находится много мишеней для модификаций, имеющих сигнальное значение

Slide 13:

В последние годы охарактеризовано много «вариантных» форм гистонов, некоторые из которых выполняют специальные функции Н1 Н5 в эритроцитах птиц варианты Н1 1 -Н1 8 в мышиных клетках Н2А macro H2A - 64% гомологии с H2A ( в неактивной копии Х хромосомы) H2A-Bbd – 42% гомологии с H2A ( в активном хроматине) H2A.Z ( в активном хроматине ) H2A.X ( маркирует мишени для репарации) Н3 С ENP - A ( центромерный белок) Cid ( центромерный белок) Н.3.3 (активный хроматин)

Slide 14:

«Основные» и «вариантные» формы гистонов кодируются разными генами

Slide 15:

Нуклеосомные частицы не вполне одинаковы Количество различных нуклеосомных глобул, которые можно построить с использованием модифицированных и вариантных форм гистонов существенно превосходит общее число нуклеосом в ядре эукариотической клетки.

Slide 16:

Связывание гистонов с ДНК не является специфичным в отношении последовательности так как гистоны не не образуют водородных связей с азотистыми основаниями Тем не менее Позиционирование нуклеосом на ДНК подчиняется определенным закономерностям Существует две важных характеристики СПЕЙСИНГ ФАЙЗИНГ

Slide 17:

probe distribution of signals after treatment with micrococcal nuclease, isolation of DNA, treatment with restriction enzyme, electrophoresis, blotting and hybridization probe phasing no phasing

Slide 18:

Азотистые основания ДНК не контактируют с гистонами. Соответственно, посадка нуклеосом на ДНК не являетсястрого специфичной в отношении последовательности. В большинстве случаев нуклеосомы расположены на ДНК случайным образом. Сушествуют, однако, свободные от нуклеосом участки (участки гиперчувствительности к ДНКазе I) и области с регулятрым расположением нуклеосом на ДНК ( phasing ). DNase I DNase I DNase I Пермеабилизация клеток Кратковременная обработка ДНКазой I Выделение ДНК Обработка рестриктазой Электрофорез, блотинг и гибридизация с пробой, комплементарной одному из концов анализируемого фрагмента

Slide 19:

Секвенирование фрагментов ДНК, накрученных на нуклеосомные глобулы, позволило выявить последовательности ДНК предпочтительные и, наоборот, неудобные для посадки нуклеосом После жесткой обработки стафилококковой нуклеазой, не деградированной остается только ДНК, связанная с нуклеосомными глобулами Выделение 145 п.н. фрагментов ДНК Секвенирование и анализ

Slide 20:

Некоторые последовательности ДНК являются предпочтительными для посадки нуклеосом в силу способности легко накручиваться на гистоновый октамер. Другие последовательности, напротив, вообще Не могут накручиваться на гистоновый октамер

Slide 21:

С учетом выявленных закономерностей разработано несколько компьютерных программ, позволяющих достаточно точно предсказать расположение нуклеосом на любой последовательности ДНК Segal et al., Nature 2006

Slide 22:

Random sequence DNA synthesis (1 each of 5 x 10 12 different DNA sequences) Make many copies by PCR Equilibrium selection of highest affinity 10% Extract DNA Clone, sequence, analyze individuals Lowary & Widom, 1998 С помощью искусственного отбора (селекс) были найдены последовательности ДНК, наиболее прочно удерживающие нуклеосомную глобулу. Такие последовательности не обнаружены ни в одном из сиквенированных геномов

Slide 23:

swi/snf activities NURF activities destabilisation sliding Transferr of nucleosomal core to another DNA sequence sliding существует три основных группы комплексов ремоделирования хроматина GROP PROTOTIPE ATPase SWI/SNF swi2/snf2 (yeast) swi2/snf2 (bromodomain) ISWI NURF (Drosophila) ISWI CHD CHD-1 (yeast) NURD (Drosophila) Chd 3/ Chd4 (Mi -2 ) (chromodomain) NURD activities sliding + deacetylation des histones (HDAC1, HDAC2) Присутствие нуклеосом на регуляторных последовательностях (например, на промоторах) может создать серьезные проблемы для работы регуляторных механизмов. Эти проблемы решаются при участии комплексов ремоделирования хроматина

Slide 24:

Nucleosomal cores are moved in a stepwise fashion swi2/snf2 – 50 bp per 1 ATP other remodelling complexes – 10 bp per 1 ATP

Slide 28:

Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences Bednar, Jan et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178 Fig. 1. (a, b, and k) Soluble chromatin from chicken erythrocyte nuclei vitrified in [approx]5 mM M+ and imaged unfixed and unstained in the frozen hydrated state

Slide 29:

Атомный силовой микроскоп

Slide 31:

Для активных генов характерна предпочтительная чувствительность к ДНКазе I при обработке последней ядер или пермеабилизованных клеток В эритроидных клетках глобиновые гены предпочтительно чувствительны к ДНКазе I  A -globin ovalbumin ДНКаза I

Slide 33:

Доменная гипотеза организации эукариотического генома Весь геном построен из однотипных блоков - доменов, которые могут включать один или несколько генов Домены в целом находятся под контролем особых регуляторных систем, которые контролируют их транскрипционный статус на уровне упаковки (более компактной или менее компактной) всего домена в интерфазной хромосоме Активный домен Неактивный домен

Slide 34:

дезацетилирование гистонов ацетилирование гистонов Повышенную чувствительность к ДНКазе I связывают с разворачиванием 30 нм фибриллы

Slide 35:

Существуют способы выделить транскрипционно-активную фракцию хроматина. С помощью аналитических методов легко убедиться, что она обогащена ацетилированными гистонами H3 H4 + _ 102 aa 135 aa + + + + + + + (Acetic Acid – Urea) 1M acid, pH ~3 in 5-8 M urea

ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА  - ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА:

ОРГАНИЗАЦИЯ ДОМЕНА  - ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА -6,1 -10,9 -14,7 -18 -21,5 эмбриональный фетальные взрослые

ДЕЛЕЦИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТАЛАССЕМИЯХ:

ДЕЛЕЦИИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТАЛАССЕМИЯХ -6,1 -10,9 -14,7 -18 -21,5 -6,1 -10,9 -14,7 -18 -21,5

Slide 38:

При Испанской талассемии домен  - глобиновых генов утрачивает предпочтительную чувствительность к ДНКазе и изменяется время его репликации (реплицируется в конце S фазы )

Регуляторные элементы, локализованные в 5’- концевой области домена  - глобиновых генов кур, обеспечивают высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии трансгенов в эритроидных клетках трансгенных мышей (Grosveld et al. 1987).:

Регуляторные элементы, локализованные в 5 ’ - концевой области домена  - глобиновых генов кур, обеспечивают высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии трансгенов в эритроидных клетках трансгенных мышей (Grosveld et al. 1987). -6,1 -10,9 -14,7 -18 -21,5  Число копий Уровень экспрессии  - глобинового гена 10 20

Slide 40:

Идентификация LCR в домене бета-глобиновых генов базировалась на двух группах экспериментальных результатов: 1. Анализ последствий делеций в 5’- концевой области домена 2. Изучение влияния изучаемых регуляторных элементов на экспрессию трансгенов

Slide 41:

 HS1 HS2 HS3 HS4 HS5

Slide 42:

 HS1 HS2 HS3 HS4 HS5 HS1 HS2 HS3 HS4 HS5      “ Транзиент ” трансфекция Анализ характера экспрессии в тканях трансгенных мышей

Slide 43:

HS1  HS2  HS3  HS4  HS5  Не выраженная активность в обоих типах экспериментов Сильный эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках Эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках Эритроид-специфичный энхансер В трансгенных мышах обеспечивается высокий и не зависящий от позиции интеграции уровень экспрессии в эритроиднах клетках Инсулятор, работающих в разных типах тканей и в клетках разных организмов MAR элемент

Slide 44:

Фрагменты ДНК, взаимодействующие с белками, можно идентифицировать с использованием метода band-shift. В дальнейшем сайты связывания белков можно картировать с использованием различных вариантов фут-принтинга экстракт специфический конкурент band-shift footprinting

Slide 45:

Во фрагментах LCR , проявляющих энхансерную активность, обнаружены многочисленные участки связывания различных транскрипционных факторов, в том числе: GATA - 1 , NF-E2, AP1, CP2, EKLF Продемонстрировано, что в эритроидных клетках, продуцирующих глобины, эти факторы связаны с LCR in vivo

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ LCR:

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ LCR 1. Прямое взаимодействие LCR с промоторами индивидуальных генов, Конкуренция промоторов за контакт с LCR 2. Распространение некого активирующего сигнала от LCR в сторону промоторов. Сборка исходного активирующего комплекса на LCR обеспечивается высокой концентрацией участков связывания белковых факторов 3. Перемещение домена из неактивного компартмента ядра в активный

Looping model:

Looping model

Механизм действия LCR “flip-flop” модель:

Механизм действия LCR “flip-flop” модель mouse В каждый конкретный момент должен экспрессироваться лишь один из генов домена Порядок активации экспрессии индивидуальных генов домена по ходу развития организма должен определяться позицией гена по отношению к LCR human

Ген, расположенный ближе всего к LCR, предпочтительно экспрессируется в эмбрионах трансгенных мышей:

Ген, расположенный ближе всего к LCR, предпочтительно экспрессируется в эмбрионах трансгенных мышей Yolk-sac Tanimoto et al., 1999

Slide 51:

Распространение активационного сигнала от LCR к промоторам LCR P1 P2 P3 P1 P2

РНК-полимераза может служить “транспортным средством”, обеспечивающим распространение активационных сигналов от LCR к промоторам индивидуальных генов Travers, 1999:

РНК-полимераза может служить “транспортным средством”, обеспечивающим распространение активационных сигналов от LCR к промоторам индивидуальных генов Travers, 1999

Slide 53:

Деффекты LCR могут быть компенсированы посредством оверэкспрессии транскрипционного фактора EKLF Crossing to mice overexpressing EKLF or defective on EKLF expression EKLF - erythroid-specific transcription factor (zinc-finger protein) that interacts with GT motif in  - globin gene promoter and in the LCR. This factor is required for  - globin gene expression in the definitive stage. It is also known to interact with SWI/SNF family of proteins.

Slide 54:

Дополнительные аргументы в пользу модели, предполагающей, что оновной чертой LCR является высокая концентрация участков связывания транскрипционных факторов, взаимодействующих и с другими регуляторными последовательностями 1. Не обнаружено ни одного белкового фактора, способного связываться только с регуляторными элементами типа LCR 2. Отдельные HSS из LCR домена  - глобиновых генов человека и других LCR способны защищать трансген от позиционных эффектов только при множественной интеграции (Ellis et al., 1993; Sabbatini et al., 1999)

authorStream Live Help