CO SO LY THUYET HPLC SAC KY LONG HIEU NANG CAO

Views:
 
Category: Education
     
 

Presentation Description

CƠ SỞ LÝ THUYẾT HPLC SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Comments

Presentation Transcript

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG :

1 C Ơ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ LỎNG

Mục tiêu học tập:

2 Mục tiêu học tập Trình bày đư ợc s ơ đ ồ của máy HPLC và vai trò của từng bộ phận . Trình bày đư ợc nguyên tắc hoạt đ ộng của detector UV-VIS . Phân biệt đư ợc các loại pha tĩnh trên nền silicagel th ư ờng dùng trong HPLC và đ ặc tính của chúng . Phân biệt đư ợc sắc kí lỏng phân bố pha thuận và pha đ ảo . Trình bày cách tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng .

Slide3:

3 Sắc Kí cột cổ đ iển Sắc Kí lỏng hiệu n ă ng cao Sắc Kí lớp mỏng Sắc kí giấy SK MẶT PHẲNG: SẮC KÍ CỘT SẮC KÍ LỎNG

Slide4:

4 Nhiều loại , nhạy Không Detector Dùng nhiều lần Bỏ sau PT Đời sống cột Ngắn , vàI phút > VàI giờ Thời gian PT  g mg L ư ợng chất dùng B ơ m cao áp ( tới 600 bar ) Do cột n ư ớc áp suất 10- 30 cm Vài cm- m Chiều dài cột 5-10  m 150-200  m Kích th ư ớc hạt Chất nhồi đă c biệt cho cột HPLC Hoá chất tinh chế Chất nhồi cột HPLC SK cột cổ đ iển Thông số HPLC: High Presure Liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao áp . HPLC: High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng hiệu n ă ng cao .

1.1. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao::

5 Cột sắc kí B ơ m Bình đ ựng dm Hệ thống tiêm mẫu Thải 1.1. Máy sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao:

1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao::

6 1.1 Máy sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao:

1.1.1. Hệ thống cấp pha động::

7 1.1.1. Hệ thống cấp pha đ ộng : Pha đ ộng th ư ờng đư ợc chứa trong bình thuỷ tinh Pha đ ộng trong sắc ký lỏng th ư ờng là hai dung môi hoà tan vào nhau. Tr ư ớc khi sử dụng , cần lọc qua màng lọc 0,45  m d ư ới áp suất giảm . Đuổi khí hoà tan trong pha đ ộng bằng cách : chạy siêu âm , sục khí tr ơ nh ư heli...

1.1.1. Hệ thống cấp pha động::

8 1.1.1. Hệ thống cấp pha đ ộng : Bình thuỷ tinh chứa hỗn hợp 2-3 dung môi Loại bỏ bọt khí: Lọc qua màng lọc 0,45  m Chạy siêu âm , sục khí tr ơ nh ư heli...

* Chương trình đẳng dòng (Isocratic)::

9 * Ch ươ ng trình đ ẳng dòng (Isocratic): Pha đ ộng th ư ờng đư ợc trộn sẵn và đ ựng trong 1 bình .

Slide10:

10 * Ch ươ ng trình dung môi (Gradient): Hỗn hợp MP mỗi dung môi đ ựng trong một bình khác nhau. Thay đ ổi tỷ lệ thành phần MP nhờ bộ trộn . Thay đ ổi tốc đ ộ dòng pha đ ộng nhờ b ơ m

Chương trình dung môi (Gradient): :

11 Ch ươ ng trình dung môi ( Gradient) : Pha đ ộng là hỗn hợp của nhiều dung môi , th ư ờng là 2  4 loại đư ợc đ ựng trong các bình khác nhau . Tỷ lệ các thành phần thay đ ổi theo ch ươ ng trình đ ã đ ịnh nhờ bộ trộn . Tốc đ ộ dòng pha đ ộng có thể thay đ ổi theo áp suất của b ơ m .

Chương trình dung môi áp suất thấp:

12 Ch ươ ng trình dung môi áp suất thấp Ba dung môi đ ựng trong ba bình riêng . Mỗi bình có van riêng lấy l ư ợng dung môi xác đ ịnh đư a vào bình hoà trộn . Sau đ ó, dùng một b ơ m đư a pha đ ộng vào van tiêm mẫu . ư u đ iểm : chỉ dùng một b ơ m Nh ư ợc đ iểm : dùng hệ thống ba van lấy ba dung môi phức tạp và chi phí cũng cao . Dung môi 1 Dung môi 2 Bộ phận hoà trộn Dung môi 3 B ơ m Van tiêm mẫu Van 3 Van 1

Chương trình dung môi áp suất cao: :

13 Ch ươ ng trình dung môi áp suất cao: Dung môi 1 Dung môi 2 Bộ phận hoà trộn Dung môi 3 B ơ m 1 Van tiêm mẫu B ơ m 3 B ơ m 2 Điểm kh¸c chñ yÕu lµ mçi dung m«i cã mét b¬m riªng, viÖc hoµ trén ®­îc thùc hiÖn ë ¸p suÊt cao. ¦u ®iÓm: cã ®é ®óng vµ ®é lÆp l¹i cao h¬n. Nh­îc ®iÓm: Ch­¬ng trinh nµy cã tèn kÐm vµ cång kÒnh h¬n lo¹i hoµ trén ë ¸p suÊt thÊp.

1.1.2. Hệ thống bơm::

14 - B ơ m cao áp là bộ phận đ ể đ ẩy pha đ ộng từ bình chứa dung môi đ i qua cột bằng áp suất cao (250-500 at). - Có thể chịu đư ợc áp suất cao và không bị dung môi ă n mòn . 1.1.2. Hệ thống b ơ m :

1.1.2. Hệ thống bơm::

15 Với cột có đư ờng kính trong bé khoảng 2,1 mm, chiều dài cột khoảng 30 mm và kích cỡ hạt nhồi 1,7 m. Máy sắc ký lỏng hiện đ ại (Ultra Performance Liquid Chromatography) có cấu hình hoàn thiện h ơ n : B ơ m tạo đư ợc áp suất cao có thể đ ến 700 bar. Tạo l ư u l ư ợng dòng dao đ ộng từ 2 - 3  l/phút đ ến 20 mL/phút . 1.1.2. Hệ thống b ơ m :

1.1.3. Hệ tiêm mẫu::

16 1.1.3. Hệ tiêm mẫu : Dung dịch mẫu phân tích đư ợc tiêm thẳng vào pha đ ộng bằng một xilanh qua van tiêm có vòng chứa mẫu . Sample loop có dung tích khác nhau: 0,50  20  L.

Nguyên lí hoạt động của van tiêm mẫu:

17 Nguyên lí hoạt đ ộng của van tiêm mẫu Tiêm mẫu Lọ thải

Slide18:

18

Autosampler:

19 Autosampler Auto sampler chứa nhiều mẫu và tiêm lần l ư ợt các mẫu vào hệ thống sắc kí theo ch ươ ng trinh đ ã chọn .

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

20 1.1.4. Cột và pha tĩnh : Cột đư ợc chế tạo bằng thép không gỉ tr ơ với hoá chất và chịu đư ợc áp suất cao.

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

21 ChiÒu dµi cét Đ­ường kÝnh trong cét Cì h¹t nhåi Lo¹i SK 1980’s 15-30 cm 4- 10 mm 5-10  m HPLC 1990’s 9-10 cm 2,1-4 mm 3,5  m HPLC > 2004 3-7,5 cm 1-2 mm 1,7  m UPLC 1.1.4. Cột và pha tĩnh :

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

22 Cột nhồi : Cột có chiều dài th ư ờng có hạt cỡ 5 hoặc 10  m. Số đ ĩa lý thuyết dao đ ộng 40000 đ ến 60000/m. 1990’s có loại cột nhỏ (microcolumn) với đư ờng kính trong 1 - 2 mm, dài 3  7,5 cm. Loại cột này đư ợc nhồi hạt cỡ 3,5  m. Có trị số N đ ến 100 000 đ ĩa/m . ư u đ iểm nổi bật của chúng là chạy sắc ký tốn ít dung môi và ít thời gian. 1.1.4. Cột và pha tĩnh :

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

23 Trong cột nhồi pha tĩnh : Pha tĩnh trên nền Nhôm oxyd Pha tĩnh trên nền cao phân tử ( Polystyren , Cellulo ) Pha tĩnh trên nền mạch carbon Pha tĩnh trên nền Silicagel . 1.1.4. Cột và pha tĩnh :

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

24 1.1.4. Cột và pha tĩnh : CÁC THÔNG SỐ CỘT Đ ư ờng kính trong Bản chất pha tĩnh Kích th ư ớc hạt nhồi Kích th ư ớc lỗ xốp Chiều dài cột

Slide25:

25 - Hình dạng tiểu phân (Particle shape) Hạt không đ ều (Irregular) Hạt hình cầu (Spherical)

Kích thước tiểu phân (Particle size): :

26 Kích th ư ớc tiểu phân (Particle size): 10 L=30cm dp=10 m L=15cm dp=5 m L= 9cm dp= 3,5 m

Kích thước tiểu phân (Particle size): :

27 Kích th ư ớc tiểu phân (Particle size):

Slide28:

28 Hạt silicagel không có lỗ xốp (Non-porous) thì S bề mặt tiếp xúc nhỏ, nên N thấp ( Hiệu lực cột thấp ). Để t ă ng hiệu lực cột , ng ư ời ta chế tạo ra hạt silicagel có lỗ xốp (Porous). Độ xốp tiểu phân (Porosity particle)

Slide29:

29 Độ xốp tiểu phân (Porosity particle)

Độ xốp tiểu phân và kích thước lỗ xốp:

30 Độ xốp tiểu phân và kích th ư ớc lỗ xốp Diện tích bề mặt bên trong của các lỗ xốp gấp 1000 lần diện tích bề mặt bên ngoài hạt silicagel. - Kích th ư ớc lỗ xốp (Pore size) th ư ờng khoảng 10 nm (150A 0 ).

1.1.4. Cột bảo vệ:

31 1.1.4. Cột bảo vệ Cột bảo vệ đư ợc đ ặt tr ư ớc cột sắc ký đ ể loại các tạp chất có mặt trong pha đ ộng . Cột bảo vệ ngắn h ơ n cột sắc ký, nhồi hạt cùng loại và kích th ư ớc hạt lớn h ơ n .

1.1.4. Cột và pha tĩnh::

32 Điều nhiệt cột : Trong sắc ký lỏng vận hành thiết bị th ư ờng ở nhiệt đ ộ phòng không cần đ iều nhiệt cột . Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đ ại th ư ờng đư ợc trang bị thêm hệ thống đ iều nhiệt cột có thể đ ến 150 o C. 1.1.4. Cột và pha tĩnh :

Slide33:

33 Detector UV-VIS Detector huỳnh quang Detector đ o chỉ số khúc xạ Detector tán xạ bay h ơ i Detector khối phổ DETECTOR

Detector UV-VIS :

34 Detector UV-VIS * Nguyên tắc hoạt đ ộng : Detector loại này thực chất là một máy đ o quang phổ UV-VIS. - Dựa vào khả n ă ng hấp thụ quang của chất PT tại b ư ớc sóng đ ã chọn đ ể đ ịnh tính va đ ịnh l ư ợng chất phân tích .

Detector UV-VIS :

35 Detector UV-VIS Dung dịch đ o là pha động chảy liên tục qua buồng chứa mẫu . Buồng đ o là cuvet đ ộng (flowcell: ống hình trụ 2R= 1mm, d= 10 mm).

:

36 Nguồn sáng : Đèn thuỷ ngân áp suất thấp . Chỉ sử dụng duy nhất 1 b ư ớc sóng đ ã đư ợc lựa chọn ( th ư ờng 254, 280, 334, 436 nm) Detector có b ư ớc sóng cố đ ịnh

:

37 - Hạn chế: Đối với các chất PT không hấp thụ quang tại b ư ớc sóng này thì không phát hiện đư ợc . Đối với các chất hấp thụ quang yếu tại các b ư ớc sóng này thì giới hạn phát hiện sẽ lớn . Detector có b ư ớc sóng cố đ ịnh

UV-VIS DETECTOR:

38 UV-VIS DETECTOR

2. Detector đo ở bước sóng thay đổi :

39 - Nguồn sáng : Đèn D 2 - Deuterium ( vùng UV: 190-360 nm) Đèn Wolfram ( vùng VIS: 360-800 nm) Ư u đ iểm : Có thể đ o ở bất kỳ b ư ớc sóng nào trong vùng UV-VIS (190 - 800 nm) 2. Detector đ o ở b ư ớc sóng thay đ ổi

VARIABLE WAVELENGTH DETECTOR:

40 VARIABLE WAVELENGTH DETECTOR

Sơ đồ detector đo ở bước sóng thay đổi. :

41 S ơ đ ồ detector đ o ở b ư ớc sóng thay đ ổi .

3. DAD - (Diod Array Detector):

42 3. DAD - (Diod Array Detector) Mảng Diod Cách tử kẻ vạch bằng lase Buồng đ o Nguồn sáng

Slide43:

43 B ư ớc sóng Mật đ ộ quang Thời gian Mật đ ộ quang X,Y= Sắc kí đ ồ Z,Y= Quang phổ Mật đ ộ quang Thời gian

Slide44:

44

Slide45:

45 - Có thể chồng phổ chất thử với chất chuẩn đ ể đ ịnh tính đư ợc ngay chất PT theo th ư viện phổ. ỨNG DỤNG DAD TRONG Đ ỊNH TÍNH

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH LƯỢNG:

46 ỨNG DỤNG DAD TRONG Đ ỊNH L Ư ỢNG Loại này có thể đ o nhiều b ư ớc sóng cùng lúc Chọn b ư ớc sóng phù hợp cho từng chất PT trong hỗn hợp mẫu .

ỨNG DỤNG DAD TRONG ĐỊNH LƯỢNG:

47 ỨNG DỤNG DAD TRONG Đ ỊNH L Ư ỢNG * Giới hạn phát hiện nhỏ cho cả 2 chất phân tích . * Phù hợp đ ể PT hỗn hợp ở nồng đ ộ thấp .

1.1.6. Bộ phận ghi và sử lí số liệu:

48 1.1.6. Bộ phận ghi và sử lí số liệu Máy ghi (Recorder) Máy tích phân (Intergrator) Máy tính với phần mềm đ iêù khiển (Computer)

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao:

49 Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao HPLC là một kỹ thuật tách các chất phân tích ra khỏi nhau khi chúng di chuyển theo pha đ ộng qua cột chứa các hạt pha tĩnh . Chất PT Pha đ ộng Pha tĩnh F 1 F 2

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao:

50 A A A A A A A B B B A B B A A A A A A A A A A A A A A A B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao

Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu năng cao:

51 A B B B B B B B B B B B B B B B B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Nguyên tắc sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao

1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao:

52 1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao Phân bố (L-LC) Hâp Phụ (L-SC) Trao đ ổi ion Sắc ký là quá trình hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt chất rắn . Pha tĩnh là chất rắn phân cực . Rây phân tử ÁI LỰC

Slide53:

53 Silicagel trần (silica)

1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao:

54 1.2. Các kiểu sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao Phân bố (L-LC) Sắc kí lỏng-lỏng : Pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh các hạt mang rắn . Sắc kí pha liên kết : Các hạt chất nhồi rắn đư ợc gắn kết với các nhóm hoá học có khả n ă ng liên kết với chất phân tích .

Silicagel biến tính:

55 Silicagel biến tính + Nhóm Silanol DC Clorosilan DC Siloxan HCl

Đặc tính của Silicagel biến tính:

56 Đặc tính của Silicagel biến tính Th ư ờng chỉ 50% nhóm Si-OH phản ứng với hợp chất Clorosilan còn 50% nhóm -OH vẫn còn trên bề mặt hạt silicagel. Nếu chạy SK phân bố pha đ ảo : Các nhóm silanol Si-OH (mang tính phân cực ) sẽ l ư u giữ các chất phân cực gây hiện t ư ợng kéo đ uôi .

Đặc tính của Silicagel biến tính:

57 Đặc tính của Silicagel biến tính Để hạn chế ảnh h ư ởng của nhóm -OH → Khoá các nhóm này bằng cách : Si-O-Si-CH 3 CH 3 CH 3 Si-OH + Cl-Si-CH 3 CH 3 CH 3 Si-O-Si-(CH 2 ) 17 -CH 3 CH 3 CH 3

Slide58:

58 Bề mặt silica của cột Ended-Capping OH OH

Đặc tính của Silicagel biến tính:

59 Silicagel 2 4 6 8 10 12 14 2. Silicagel pha liên kết chỉ bền trong vùng pH = 2-8. Nên pha đ ộng chỉ pha trong vùng pH này . Đặc tính của Silicagel biến tính Liên kết Si-R dễ bị thuỷ phân thành Si-OH Nền Silica sẽ bị thuỷ phân

Slide60:

60 * C ơ chế tác đ ộng của SK phân bố F 1 F 1 F 2

* Pha tĩnh phân cực:

61 * Pha tĩnh phân cực * Pha tĩnh không phân cực -(CH 2 ) 17 -CH 3 ODS (C 18 ) Octadecyl siloxan -(CH 2 ) 7 -CH 3 OS (C 8 ) Octa siloxan - C 6 H 5 (C 6 H 5 ) Phenyl siloxan -(CH 2 ) 2 -NH 2 Amino -(CH 2 ) 2 -CN Cyano - (CH 2 ) 2 -O-CH(OH)-CH 2 OH Diol

2. Pha động: :

62 2. Pha đ ộng : TT Tªn dung m«i Dé ph©n cùc (P ' ) * 1 n-hexan 0,1 2 Benzen 2,7 3 Metylen clorid 3,1 4 n-propanol 4,0 5 Tetrahydrofuran 4,0 6 Ethyl acetat 4,4 7 Cloroform 4,1 8 Aceton 5,1 9 Ethanol 4,3 10 Acid acetic 6,0 11 Acetonitril 5,8 12 Methanol 5,1 13 N­ước 10,2 Dung môi PC mạnh Dung môi PC trung bình Dung môi không PC

Độ phân cực của hỗn hợp dung môi:

63 Độ phân cực của hỗn hợp dung môi P’ AB = T A .P’ A + T B .P’ B P’ AB =(0.60).(10,2) + (0,40). (5,1) = 8,2 Độ phân cực của hỗn hợp N ư ớc:Methanol = 60:40. P’ AB =(0.40).(10,2) + (0,60). (5,1)=7,1 Độ phân cực của hỗn hợp N ư ớc:Methanol = 40:60.

3. Chất phân tích:

64 3. Chất phân tích Độ phân cực của chất phân tích : Dựa vào khung hoá học : - Khung carbon càng dài , càng cồng kềnh càng kém phân cực . - Hydrocarbon mạch thẳng kém phân cực h ơ n hydrocarbon th ơ m . Dựa vào nhóm chức . Độ phân cực của nhóm chức hữu c ơ t ă ng dần theo thứ tự: Dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester aldehyd ceton < alcol  amin < sulfon < sulfoxid < amid < acid carbonxylic < n ư ớc .

3. Chất phân tích:

65 3. Chất phân tích Dựa vào mạch Carbon: - Mạch carbon càng dài , càng kồng kềnh thì đ ộ phân cực càng giảm . - Hydrocarbon mạch thẳng kém phân cực h ơ n hydrocarbon th ơ m . 3.1. Chất Phân cực : Độ phân cực của chất phân tích phụ thuộc vào : trọng l ư ợng phân tử ( mạch C) và các nhóm chức .

3. Chất phân tích:

66 3. Chất phân tích 3.1. Chất Phân cực : Dựa vào nhóm chức . Các nhóm chức có nguyên tử mang đ iện âm : O, N, S, F, Cl… nh ư : -OH, -CO, -NO 2 , -NH 2 , -COOH… là các nhóm phân cực . Chất PT chứa càng nhiều nhóm PC thì PC càng mạnh . Các chất phân cực th ư ờng tan trong n ư ớc và các dung môi phân cực .

3. Chất phân tích:

67 3. Chất phân tích 3.2. Chất không phân cực : Chất không Phân cực là: Các chất HC không chứa các nhóm phân cực hoặc 1 nhóm PC yếu . Chất không PC đ ều tan trong ete và các dung môI không PC. Ng ư ợc lại , không tan trong n ư ớc và các dung môI PC.

3. Chất phân tích:

68 3. Chất phân tích 3.3. Chất phân cực trung bình : Chất PC trung bình là chất không ion hóa , có số mạch C <5, có 1 nhóm PC nh ư ng không phảI là nhóm PC mạnh . Chất PC trung bình là chất vừa tan trong n ư ớc vừa tan trong ete.

4. Nguyên tắc chọn pha tĩnh và pha động?:

69 Nếu có hỗn hợp chất phân tích : Dự đ oán đ ộ phân cực của từng chất trong hỗn hợp dựa vào cấu trúc hoá học . 2. Chọn pha tĩnh có đ ộ phân cực gần với đ ộ phân cực của các chất phân tích . 3. Chọn pha đ ộng có đ ộ phân cực khác xa với đ ộ phân cực pha tĩnh . 4. Nguyên tắc chọn pha tĩnh và pha đ ộng ?

5. Sắc ký pha thuận và pha đảo::

70 5. Sắc ký pha thuận và pha đ ảo : Pha tĩnh lỏng phân cực : Triethylen glycol, n ư ớc . Pha đ ộng là dung môi ít phân cực h ơ n : hexan, iso propyl ether. Sắc ký pha thuận (normal-phase chromatography). Pha tĩnh không phân cực nh ư hydrocarbon. Pha đ ộng phân cực h ơ n pha tĩnh : n ư ớc , acetonitril. Loại sắc ký này với đ ộ phân cực của pha tĩnh và pha đ ộng ng ư ợc với sắc ký pha thuận . Sắc ký pha đ ảo (reversed-phase chromatography).

Sắc kí phân bố pha thuận:

71 Sắc kí phân bố pha thuận Chọn pha tĩnh ? Phân cực : R là diol, amino, cyano. Chọn pha đ ộng ? Không phân cực : n-hexan, Metylen clorid, CHCl 3….. Chất phân tích Phân cực ?

Slide72:

72 Chất không phân cực Chất phân cực . Chất phân cực Chất ít phân cực Muốn thời gian l ư u giảm t ă ng đ ộ phân cực của pha đ ộng .

Sắc kí phân bố pha đảo:

73 Sắc kí phân bố pha đ ảo Chọn pha tĩnh ? Không phân cực : R là C 2 , C 4 , C 8 , C 18 , phenyl…. Chọn pha đ ộng ? Phân cực : Acetonitril, Methanol, N ư ớc … Chất phân tích không phân cực ?

Slide74:

74 Muốn thời gian l ư u giảm giảm đ ộ phân cực của pha đ ộng . Chất không phân cực Chất phân cực Chất ít phân cực

Tại sao thường sử dụng SK pha đảo?:

75 Tại sao th ư ờng sử dụng SK pha đ ảo ? Thuốc muốn đư ợc hấp thu thừ ơ ng phải đ i qua màng sinh học . Màng này có lớp lipid kép nên đ a phần thuốc th ư ờng dạng thân lipid ( không phân cực ) dễ hấp thu. 2. Dung môi phân cực rẻ h ơ n và ít gây đ ộc h ơ n dung môi không phân cực .

Hạn chế của SK pha đảo?:

76 Hạn chế của SK pha đ ảo ? Không phân tích đư ợc các chất rất phân cực . Hỗn hợp nhiều thành phần có cả chất phân tích phân cực và không phân cực . Phải chạy cả SK phân bố pha thuận và pha đ ảo Tìm cách phân tích đư ợc chất rất phân cực bằng SK phân bố pha đ ảo ???

Slide77:

77 Khi phân tích các acid HC có pk a =4-5. + pH<pk a -2: HA + pH>pk a +2: A - Nên chạy SK trong môi tr ư ờng : 2<pH<pk a -2 đ ể hạt silicagel không bị phân huỷ.

Slide78:

78 Khi phân tích các base HC có pk a =8-10. + pH<pk a -2: BH + + pH>pk a +2: B Nên chạy SK trong môi tr ư ờng : + pH>pk a +2: Để base HC tồn tại dạng phân tử (B) thì hạt silicagel bị phân huỷ. Phải dùng cột polymer (polystyren) + Nếu muốn chạy SK trong môi tr ư ờng 2<pH<pka-2, đ ể pha tĩnh ổn đ ịnh thì base tồn tại dạng BH +

Slide79:

79 Thêm một đ ối ion vào trong pha đ ộng : nh ư Natri Laurylsulfat (LS - Na + ), Natri heptansulfonat. Các anion này (LS - ) chiếm vào liên kết Si-OR làm cho bề mặt pha liên kết thành trao đ ổi ion. Khi BH + đ i vào cột tạo cặp ion BH + LS - sẽ bị l ư u giữ trên cột và đư ợc rửa giải khỏi cột theo nguyên tắc SK phân bố pha đ ảo . SK phân bố pha đ ảo tạo cặp ion:

Slide80:

80 Nếu tách cation? Thêm một anion vào trong pha đ ộng : nh ư Natri Laurylsulfat (LS - Na + ), Natri heptansulfonat… Na + Na + Na + LS - Na + Na + BH + BH + Na + X - X - BH + X - Silicagel SK phân bố pha đ ảo tạo cặp ion:

Slide81:

81 Khi BH + đ i vào cột tạo cặp ion BH + LS - ( chất không phân cực ). Sẽ bị l ư u giữ trên cột và rửa giải theo nguyên tắc SK phân bố pha đ ảo . SK phân bố pha đ ảo tạo cặp ion:

Slide82:

82 Giải thích tại sao khi đ ịnh l ư ợng B1, B2, B6 th ư ờng cho Natri Heptansulfonat vào trong pha đ ộng ?

SK phân bố pha đảo tạo cặp ion::

83 Nếu tách các anion? Đ ư a một thuốc thử tạo là cation vào pha đ ộng . Nh ư : Muối amoni bậc bốn Tetrabutylammonium (R 4 N + X - ) SK phân bố pha đ ảo tạo cặp ion:

VD: Hãy dự đoán thứ tự rửa giải của hỗn hợp 4 chất sau trong ĐK SK phân bố pha đảo.:

84 VD: Hãy dự đ oán thứ tự rửa giải của hỗn hợp 4 chất sau trong ĐK SK phân bố pha đ ảo .

Slide85:

85

Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao:

86 Các kiểu sắc ký lỏng hiệu n ă ng cao Phân bố (LLC) Hâp Phụ (LSC) ÁI LỰC Trao đ ổi ion Rây phân tử Sắc ký là quá trình hấp phụ của chất phân tích trên bề mặt chất rắn . Pha tĩnh là chất rắn phân cực .

1.2.2. Sắc ký hấp phụ hiệu năng cao: :

87 1.2.2. Sắc ký hấp phụ hiệu n ă ng cao: * C ơ chế tác đ ộng của SK hấp phụ Chất phân tích tranh chấp với pha đ ộng ở các vị trí hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh . L ư u giữ chất phân tích là do lực hấp phụ.

1. Pha tĩnh:

88 1. Pha tĩnh a. Silicagel: - Silicagel trần (Silica) là chất hấp phụ thân n ư ớc . Khả n ă ng hấp phụ của nó là do các nhóm hydr oxyl (–OH) trên bề mặt quyết đ ịnh . ổn đ ịnh trong vùng pH hẹp:2-8

1. Pha tĩnh:

89 b. Nhôm oxid (Aluminas): - Nhôm oxid ổn đ ịnh trong vùng pH=2-12. Aluminas có các dạng khác nhau: + Dạng base với giá trị pH là 9,0-10,0 dùng tách các chất có tính base nh ư : amin, acid amin. + Dạng acid với pH=4,0-4,5 dùng tách các hợp chất có đ ặc tính acid. + Dạng trung tính với pH=7,0-8,0 dùng tách các hợp chất hydrocarbon no, aldehyd, ceton... 1. Pha tĩnh

2. Pha động::

90 2. Pha đ ộng : Để rửa giải các chất đ ã bị hấp phụ, ng ư ời ta dùng pha đ ộng có sức rửa giải phù hợp dựa vào hằng số đ iện môi  o . Trị số  o càng lớn , sức rửa giải càng mạnh . Nếu pha đ ộng gồm nhiều dung môi , dựa vào phân số mol của từng dung môi đ ể tính trị số  o của hệ.

Slide91:

91 Phân bố pha đ ảo Phân bố pha thuận Hấp phụ Trao đ ổi ion Chất không tan/n ư ớc Chất tan/n ư ớc Ion Chât không PC Phân bố

Slide92:

92

Slide93:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl). Pha động là H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol). Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian chạy mẫu Pha tĩnh-Pha đảo (Stationary Phases for Reversed-Phase LC) Pha tĩnh bình thường của LC (Stationary Phases for Normal LC) Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene… Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu

Slide94:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách Pha đảo

Slide95:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý của HPLC

Slide96:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu đối với dung môi Áp suất bơm: vài trăm atm (  6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min -1 với E<0,5% Vật liệu bơm bền ăn mòn đối với nhiều loại dung môi khác nhau Chế độ bơm piston Cỡ hạt trong cột sắc ký: 3 - 10 m Một hoặc nhiều bình chứa dung môi (500 ml) Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger) Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục

Slide97:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hiệu quả tách bằng phương pháp gradient elution Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi: isocratic Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực (polarity) khác nhau nhiều: gradient elution Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc theo từng bậc Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve seperation efficiency) Quá trình tách rửa (Elution)

Slide98:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Polar Solvents Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile Non-polar Solvents N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC Lựa chọn pha động và pha tĩnh Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha tĩnh là tương đương còn pha động có độ phân cực sai biệt Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: thương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài

Slide99:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC

Slide100:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hệ thống nạp mẫu (Sample Injection Systems) Sử dụng valve 6 cổng Nạp mẫu qua vòng lấy mẫu (sampling loops)  Sắc ký lỏng hiện đại Có thể thay thể sampling loops từ 5  l đến 500  l Sai số của lượng mẫu nạp dưới 1%

Slide101:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Cột sắc ký HPLC Thông thường: L = 10 – 30 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 4 – 10 mm, kích thước hạt nhồi: 3, 5 và 10 m 40.000 – 60.000 đĩa/m cột Cột tốc độ cao và hiệu quả hơn L = 3 - 7 cm và có thể nối tiếp 2 cột hoăc nhiều hơn ID = 1 – 4,6 mm, kích thước hạt nhồi: 3 hoặc 5 m 100.000 đĩa/m cột Cột bảo vệ (Guard Column) Được lắp đặt trước cột phân tách để kéo dài tuổi thọ của cột Thành phần = thành phần của cột phân tách nhưng cỡ hạt lớn hơn để giảm tổn thất áp suất

Slide102:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ổn định nhiệt độ của cột (Column Thermostats) Phần lớn ứng dụng cua HPLC được thực hiện ở nhiệt độ phòng Tuy vậy chất lượng của sắc ký đồ sẽ tốt hơn nếu duy trì nhiệt độ của cột không thay đổi (sai số < 0,05°C) Thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm lò gia nhiệt cho cột (Column heater) ổn định nhiệt độ ở gần 150°C với sai số < 0,05°C Trang bị hệ thống phun nước làm lạnh (water jackets fed) từ bể ổn nhiệt để khống chế chính xác nhiệt độ

Slide103:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Đầu dò (Detector) dùng cho HPLC Không nhạy và có khả năng phân tích đa dạng như detector của GC Thường gặp nhất là Detector UV-Vis LOC: Limit Of Detection Mass LOD = concentration (mol/L) x inj. vol. (L) x FW (g/mol)

Slide104:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) UV-Vis and Fluorescence Detector Electrochemical Detector Amperometric detection = fixed potential and measure the current response.  = 200-400nm  sử dụng 254 nm

Slide105:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Refractive Index Detector

Slide106:

B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các phương pháp nâng cao độ phân giải trong HPLC Tăng chiều dài của cột (Increase column length) Giảm đường kính của cột (Decrease column diameter) Giảm lưu lượng pha động (Decrease flow-rate) Pha tĩnh (vật liệu nhồi cột) đồng nhất (Uniform stationary phase (packing)) Giảm thể tích bơm mẫu (Decrease sample size) Lựa chọn pha tĩnh sạch hơn (Select proper stationary phase) Lựa chon pha động tinh khiết hơn (Select proper mobile phase) Sử dụng áp suất ổn định hơn (Use proper pressure) Thành phần của pha động thay đổi hợp lý (Use gradient elution)

Slide107:

So sánh HPLC và GC (Comparison of HPLC and GLC) Các đặc điểm chung: Hiệu quả, độ chọn lọc cao, ứng dụng rộng rãi Thể tich mẫu nhỏ Có thể không phá hủy mẫu (nondestructive of sample) Định lượng dễ dàng Ưu điểm của HPLC Áp dụng được với các mẫu không bay hơi và không bền nhiệt Áp dụng được cho các ion vô cơ Ưu điểm của GC Thiết bị đơn giản và rẻ Nhanh chóng Dễ dàng kết nối với phổ khối

authorStream Live Help