Ung dung cua sac ky loc gel GFC trong phan tich thuc pham

Views:
 
Category: Education
     
 

Presentation Description

BCKH Ứng dụng của sắc ký lọc gel (GFC) trong phân tích thực phẩm

Comments

Presentation Transcript

slide 1:

HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING BÁO CÁO KHOA HỌC ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Đề tài: Ứng dụng của sắc ký gel GF trong phân tích thực phẩm Thực hiện: Nguyễn Văn Tú - PhD Student 51301915 TPHCM 2017

slide 2:

2 GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL 1 NGUYÊN LÝ SẮC KÝ GEL 2 PHÂN LOẠI GEL 3 NỘI DUNG ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL 4

slide 3:

3 GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL Sắc kí gel dùng để tách các phân tử dựa trên sự khác nhau về kích thước của các phân tử. Những phân tử không bị giữ lại bằng liên kết hóa học nên thành phần của dung môi giải li buffer không ảnh hưởng trực tiếp đến độ giải li resolution.

slide 4:

4 Thường được sử dụng để tinh chế proteins enzymes polysaccharides nucleic acids và các đại phân tử trong lĩnh vực sinh học. GIỚI THIỆU SẮC KÝ GEL

slide 5:

5 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Trong sắc ký gel pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng và các lỗ rỗng này được phủ đầy dung môi dùng làm pha động.

slide 6:

6 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 7:

7 NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL - Gel được nhồi vào cột tạo thành đệm đệm là mạng lưới lỗ xốp hình thành từ hạt hình cầu bền vật lý bền hóa học và trơ. Lớp gel cân bằng với dung dịch đi qua và dung dịch điền đầy vào mạng lưới lỗ xốp và khoảng không giữa các hạt. - Chất lỏng bên trong lỗ xốp được xem là pha tĩnh chất lỏng bên ngoài lỗ xốp là pha động. - Mẫu được đưa vào cột Pha động kéo mẫu di chuyển qua cột. - Phân tử khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp những phân tử nhỏ đi vào sâu trong lỗ xốp và bị giữ lại trong cột lâu hơn. - Pha động qua cột liên tục các phân tử lớn không thể chui vào các lỗ xốp nên sẽ đi ra khỏi cột trước. Những phân tử nhỏ khuếch tán vào và ra khỏi lỗ xốp nên ra khỏi cột sau.

slide 8:

8 PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 9:

9 PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Kết quả của quá trình sắc kí gel thường được biểu diễn trên giản đồ giải li hay phổ đồ sắc ký cho thấy sự khác nhau về nồng độ liên quan đến mức độ hấp thu tia UV ở vùng 280 nm của các thành phần trong mẫu khi chúng được giải li khỏi cột dựa trên trật tự về kích thước phân tử. Trên giản đồ chia ra làm 3 loại phân tử. Những phân tử không vào mạng lưới đệm mà được giải li thẳng ra khỏi cột với cùng tốc độ cùa dòng lưu chất của pha động buffer ở thể tích Vo xét trên 1 đơn vị thể tích cột gọi là thể tích khoảng trống void volume. Những phân tử có một phần đi vào mạng lưới đệm silicagel rồi mới giải li ra khỏi cột theo trật tự kích thước nhỏ hơn sẽ ra trước. Và còn lại là những phân tử được giữ hoàn toàn trong mạng lưới lỗ xốp và đi ra khỏi cột trước giá trị tổng thể tích cột Vt total column volume của pha động đi qua cột.

slide 10:

10 Cách xác định thể tích Ve elution volume trên sắc ký đồ: Khi t hể tích c ủa mẫu quá n hỏ so v ới t hể tích rửa giải Ve thì Ve đ ư ợc xác địn h từ vị trí ban đầ u đ ến vị trí cao nhấ t của mũi sắc ký Trạng thái của mỗi cấu tử được biểu diễn liên quan đến thể tích giải li của chúng được đo trực tiếp từ phổ đồ sắc ký. Có 3 cách: PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 11:

11 Khi thể tích của mẫu lớn không thể bỏ qua so v ới thể tích rửa giải Ve thì Ve đượ c xác đị nh từ vị trí ½ thể tích mẫu đến vị trí cao nhấ t của mũi sắc ký. PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 12:

12 Khi thể tích của mẫu quá lớn t ạo nên mũi sắc ký có vùng phẳng ngang thể tích Ve được xác định từ vị trí ban đầu của mẫu đến vị trí của điểm uốn ở phần đang t ăng lên của mũi giải li. PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 13:

13 gelmatrix o t o e i o e d V V V V V V V V K       o t o e av V V V V K    PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 14:

14 gelmatrix o t o e i o e d V V V V V V V V K       o t o e av V V V V K    PHỔ ĐỒ SẮC KÝ GEL NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL - V o là thể tích khoảng tr ống c ột được nhồi t ốt thì thể tích V o x ấp xỉ 30 thể tích c ột. - V i là thể tích pha động bên trong mạng lưới trong thực tế V i r ấ t khó xác địn h do phải xác đị nh thể tích mạng lướ i gel do đó để thu ận ti ện thì V i V t -V o .

slide 15:

15 Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 16:

16 Đường cong chọn lọc và lựa chọn phương pháp NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL - Hệ số phân bố K av liên quan đến kích t hước c ủa phân tử. Tỷ tr ọ ng và kích thước giố ng nhau c ủa các phân tử mô tả mối quan hệ giữ a giá trị K av và logM r . - Bằng cách vẽ đườ ng cong đi qua nhữ ng điểm giá trị K av ứng v ới logM r của các protein c hu ẩn có t hể xây dự ng được đường cong chọn lọc. - Ph ươ ng pháp lọc gel được chọn lựa sao cho khối lư ợ ng phân tử lớ n đ ược giải li ở thể tích khoảng tr ốn g V o v ới mũi giãn r ộng ít nhấ t và thời gian là t ối thi ểu. - Những hợ p c hấ t có khối lượ ng phân tử nhỏ nhấ t được giải li g ần giá trị V t

slide 17:

17 uf Độ phân giải độ giải li NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 18:

18 Độ phân giải độ giải li NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL Độ giải li là độ phân tách giữa các peak chịu ảnh hưở ng bởi nhiều y ếu tố: tỷ lệ thể tích mẫ u v ới thể tích c ột t ốc độ chả y kích thước c ột kích thư ớc hạ t gel độ phân bố kích thước hạ t gel tỷ tr ọn g c ột nhồi độ x ốp của hạ t và độ nhớt c ủa pha độ n g. Thành công của phươ ng pháp phân tích sắc ký gel l ựa chọn điều kiện sao cho độ chọn lọc cao và khố ng chế sự của ng oại c ảnh trong quá trình tách. Vr1 và Vr2 là thể tích lưu chấ t ra khỏi c ột của 2 peak liền kề tính ở tâm peak W1 và W2 độ r ộng của các peak Vr2 – Vr1 là khoảng cách giữa các peak và 1/2 W1 + W2 độ r ộng trung bình của các peak

slide 19:

19 Độ phân giải NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 20:

20 Phân tách với độ giải li cao High resolution fractionation: Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng phân tử. Độ phân giải NGUYÊN LÝ CỦA SẮC KÝ GEL

slide 21:

21 PHÂN LOẠI GEL Việc tách trong sắc ký gel tùy vào đặc điểm của lỗ rỗng trong hệ mạng không gian ba chiều. Hạt gel phải có: + Kích cỡ giống nhau + Trơ về mặt hóa học + Bền về mặt cơ học + Các lỗ rỗng trong hạt gel phải có hình dạng đồng nhất

slide 22:

22 Có hai loại nguyên liệu để chế tạo gel là xerogel và aerogel. + Xerogel là loại gel cổ điển là một polymer được tạo mạng ngang khi cho tiếp xúc với dung môi gel sẽ trương nở để tạo thành mạng gel với các lỗ trống tương đối mềm. + Aerogel: là nguyên liệu rắn chắc không phải gel vd: thủy tinh có lỗ rỗng hay silica có lỗ rỗng. PHÂN LOẠI GEL

slide 23:

23 Khi lựa chọn gel sử dụng cần cần xem xét 2 yếu tố: + Mục tiêu thí nghiệm phân tách với độ phân giải cao hay tách thành từng nhóm hợp chất + Khối lượng của protein cần tách và tạp chất cần tách. Trên thị trường có 5 nhóm thông dụng là Superdex Serphacryl Superose Sephadex Sephadex LH - 20 PHÂN LOẠI GEL

slide 24:

24 SUPERDEX PHÂN LOẠI GEL Là sự lựa c h ọn cho độ g iải li cao th ờ i gian n g ắn và độ thu h ồi cao. Là một loại composite dựa trên liên k ế t ngang giữ a các h ạ t r ỗn g agrose đến mạng dextran b ằn g liên k ế t cộng hóa trị. Có độ b ền v ậ t lý và hóa h ọc cao do mạn g agrose liên k ế t ngang và các tính chấ t lọc gel t ốt do c h uỗi dextran. Độ b ền cơ hoc của Superdex cho phép nh ững dung môi g iải li có độ n h ớ t cao n hư ure 8M c h ả y qua v ớ i t ốc độ dòng khá lớn. Loại gel này có th ể ch ịu đ ượ c t ốc độ dòng cao trong suốt quá trình ổn địn h hay lúc r ửa cột. Tính b ền giúp Superdex phù hợp cho sử d ụn g trong công ngh iệp v ớ i t ốc độ dòng cao nhanh và h iệu quả làm sạc h t ại chỗ. V ớ i điều kiện làm việc bình t hường nh ững t ươn g tác g i ữa protein và gel Superdex đ ượ c bỏ qua khi sử dụng dung môi có nồ ng độ ion trong kh oản g 015M đến 15M.

slide 25:

25 Được sản xuất với 2 loại kích thước hạt 13 mm và 34 mm với 4 loại chọn lọc khác nhau Superdex Peptide Superdex 30 Superdex 75 and Superdex 200. + Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt có kích thước 13 mm của Superdex Peptide Superdex 30 Superdex 75 and Superdex 200 cho phân tích độ phân giải cao với thể tích mẫu nhỏ. + Sử dụng cột được nhồi sẵn hạt có kích thước 34 mm của Superdex prep grade cho qui mô công nghiệp. SUPERDEX PHÂN LOẠI GEL

slide 26:

26 SUPERDEX PHÂN LOẠI GEL

slide 27:

27 SEPHACRYL Sephacryl là sự lựa chọ n cho phân tách nhanh độ thu hồi cao t ại phòng thí nghiệm và qui mô công nghiệp. Sephacryl HR thay thế cho Superdex prep grade trong những ứng dụng yêu c ầ u các khoảng phân đo ạ n tươ ng đối r ộng độ b ền hóa cao và chịu được t ố c độ dòng lowsnlafm cho Sephacryl phù hợp cho sử dụng công nghiệp. PHÂN LOẠI GEL

slide 28:

28 Sephacryl HR là mộ t loạ i composite được hình thành bởi liên k ết ngang c ộn g hóa trị g iữa allyl dextran v ới NN ’-methylane bisacrylamine t ạo nên mạng ưa nướ c có độ bền cơ học cao. SEPHACRYL PHÂN LOẠI GEL

slide 29:

29 SEPHACRYL PHÂN LOẠI GEL

slide 30:

30 Superose có thể dùng trong các phân đo ạn khối lượ ng phân tử r ộng nhưng không phù hợp cho phân tách quy mô công nghiệp. SUPEROSE PHÂN LOẠI GEL Superose là loại gel bền v ậ t lý và hóa họ c cao d ựa trên liên k ế t ngang của phân tử lỗ x ốp agarose. Một vài tươn g tác kỵ n ướ c c ần chú ý đặc trưn g là các phân tử kỵ n ư ớ c nh ỏ aromatic peptides membrane proteins lipoproteins có t hể đ ược giải li ch ậm hơ n dự đoá n. Tuy nhiên trong một số ứng d ụng nhữ n g t ương tác này có t hể làm t ăng độ giải li của quá trình phân tách.

slide 31:

31 Superose được sản x uấ t v ới các kích thước hạ t khác nhau 11 µm 13 µm and 30 µm và v ới các độ chọn lọc khác nhau Superose 6 Superose 12. SUPEROSE PHÂN LOẠI GEL

slide 32:

32 SEPHADEX PHÂN LOẠI GEL

slide 33:

33 SEPHADEX PHÂN LOẠI GEL Sephadex dùng để tách nhanh nh ữn g nhóm có khối lư ợng phân tử nhỏ khử muối đổi dung môi và làm sạc h mẫu. Sephadex được t ạo thành từ các liên k ế t ngang của dextran v ới epichlorohydrin. Các loại khác nhau của Sephadex là do mức độ khác nhau của liên k ế t ngang và vì v ậ y nó có độ trư ơng nở và độ chọn lọc cho các kích thư ớc phân tử đặc trư ng.

slide 34:

34 SEPHADEX PHÂN LOẠI GEL

slide 35:

35 SEPHADEX PHÂN LOẠI GEL Sephadex G-10 phù hợ p cho việc tách nh ữn g phân tử sinh học như peptides M r 700 ra k hỏi nhữ ng phân tử nhỏ M r 100 Sephadex G-50 phù hợ p tách những phân tử có M r 30.000 ra hỏi nhữ ng phân tử có M r 1500 nhữ ng labeled protein hay DNA. Loạ i gel này còn đ ược sử dụ ng để loại bỏ các nucleotic nhỏ ra khỏi các c huỗi axit nucleic mạch dài. Sephadex G-25 đ ượ c ứng dụ ng chính để tách nhóm protein dạ ng c ầu. Loại gel này hi ệu quả trong vi ệc kh ử muối hay nhữ ng chất bẩn nhỏ ra khỏi nh ững phân tử có M r 5000.

slide 36:

36 SEPHADEX LH-20 PHÂN LOẠI GEL

slide 37:

37 - Sephadex LH-20 được t ạ o thành từ nhữ ng ch uỗi hydroxypropylated dextran có liên k ế t ngang đến mạng lư ới polysaccharide. Loạ i này có thể trư ơ ng nở trong nư ớc hoặc dung môi hữ u cơ. - Sephadex LH-20 phù hợ p cho giai đo ạn tinh c hế ban đầu trước khi tinh c hế v ới độ tinh k hi ế t cao bằng sắc ký trao đổi ion hay sắc ký pha đảo hay nó có thể dung trong giai đoạn tinh c hế v ới độ tinh khi ế t cao đối v ới đồng không đối quang. - Sephadex LH-20 có thể tách những c ấu tử bằ ng sự phaanchia giữ a mạng gel và dung môi hữ u cơ. Gel Sephadex LH-20 có cả tính ưa nư ớc và kị nư ớc. SEPHADEX LH-20 PHÂN LOẠI GEL

slide 38:

38 SEPHADEX LH-20 PHÂN LOẠI GEL

slide 39:

39 SEPHADEX LH-20 PHÂN LOẠI GEL Sephadex LH-20 được sử dụng tách sơ bộ 2-acet- amidobenzoic acid và 4-acetamidobenzoic acid.

slide 40:

40 ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL Tách các nhóm phân tử Group separations: Loại bỏ những phân tử nhỏ như muối protein đánh dấu ra khỏi nhóm các phân tử lớn. Thường được sử dụng để tinh chế protein kết hợp khử muối và đổi dung môi.

slide 41:

41 ỨNG DỤNG SẮC KÝ GEL Phân tách với độ giải li cao High resolution fractionation: Phân tách nhiều cấu tử trong một mẫu dựa trên sự khác nhau về kích thước. Mục đích là phân lập một hoặc nhiều cấu tử để xác định khối lượng phân tử hoặc phân tích sự phân bố khối lượng phân tử.

slide 42:

42 ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỌC GEL Sử dụng c ột sắc ký gel để phân tách dự a trên sự khác biệ t về khối lượ ng phân tử để loại muối và nh ững phân tử nhỏ. Cột được nhồ i v ớ i Sephadex G-25 chỉ trong một bư ớ c mẫu sẽ đượ c loại bỏ muối nhữ ng phân tủ nhỏ.

slide 43:

43 ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỌC GEL Sắc ký đồ quá trình khử muối ra khỏi His 6 protein bằng AKTA prime

slide 44:

44 ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỌC GEL - Mẫu được khử muối trên cột Hitrap Desalting 5ml với chương trình AKTA prime cài đặt sẵn. -Dung môi giải li là natri phosphate 20mM natri clorua 015M pH7. -Tín hiệu đầu ra của protein được xác định bằng tia UV 280nm và tín hiệu đầu ra của muối được xác định bằng độ dẫn điện.

slide 45:

THANK YOU

authorStream Live Help