LCR

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Réalisé par : AOUMRI Mohammed MABROUK Ayoub Responsable: Mr M. BARAKAT :

Réalisé par : AOUMRI Mohammed MABROUK Ayoub Responsable: Mr M. BARAKAT Université Cadi Ayyad Faculté des Sciences Semlalia Département de Biologie La Ligase Chain Réaction

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PLAN Introduction Principe technique de la LCR Application Avantages Conclusion

INRODUCTION:

INRODUCTION La LCR (ligase chain reaction ou réaction de ligature en chaîne) est une méthode développée par Landgren en 1988 permettant l'amplification d'une sonde complémentaire d'une ADN cible

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Avec LC R il n’y a pas de synthèse d’acide nucléique (ADN ou ARN) comme dans les techniques d’amplification génétique (PCR) il y a liaison entre deux sondes oligonucléotidiques par la ligase ce qui engendre l’accumulation de dimères.

Principe de la LCR:

Principe de la LCR Deux oligonuclèotides s’hybrident avec des séquences adjacentes présentes sur l’ADN cible puis une ADN ligase lie les deux oligonucléotides par une liaison covalente l’hybride est en suite dissocie par la chaleur et le dimère de sondes est détaché de la cible qui devient libre pour hybrider deux nouvelles sondes On répète l’ensemble de ces opération un nombre de fois suffisant pour obtenir le nombre de molécules de sondes ligaturées

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Identification des gènes anormaux Détection des Maladies Génétique Détection des Mutations

Application de la LCR:

Application de la LCR La Technique de la LCR est utilisée dans: le diagnostic de certaines MST ( Maladies Sexuellement transmissible) le diagnostic d’autre maladies comme la Tuberculose…

technique de la LCR:

technique de la LCR

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La LCR peut être réaliser avec divers ligase comme : la ligase du phages T4 la ligase d’E coli la LCR devient réellement performante et utilisable en routine grâce à l’emploie d’une ligase thermostable.

Pour réaliser la LCR on a besoin de: ADN cible La Ligase Sondes Oligonucléotidique :

Pour réaliser la LCR on a besoin de: ADN cible La Ligase Sondes Oligonucléotidique

Préparation de l’échantillon :

Préparation de l’échantillon Volume de la réaction: 10-50µl Ligase thermostable ADN cible Sondes olégonucléique Tampon: 20- - 50mM Tris-HC1 ( pH 7.6 ) 100mM mKC1 10mM MgCI2 1mM EDTA 10mM DTT 1mM NAD

Processus amplification:

Processus amplification G-C C -G B D G-C G D C B ligase thermostable ( ) n ( ) n Ligature à 65 o C 1 Denaturation à 94 o C 2 Répéter l étape 1, puis 2 pour 20 cycles C -G B D C -G B D C -G B D ADN cible Sondes olégonucléique

Détection des produit amplifies :

Détection des produit amplifies Il peut être détecter soit par : ELISA Electrophorèse

Détection par ELISA:

Détection par ELISA Microplaque Anticorps Anti digoxigenin ( ) lié à un enzyme(alkaline phosphatase) Substrat PNP phosphate D

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SA C -G B D SA C B

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SA C -G B D SA C B

avantages:

avantages La LCR utiliser un nombre relativement important de paires de sondes au cours d’une même réaction (jusqu’à douze cible ). elle fonctionne avec deux températures seulement. Une pour l’hybridation et la ligature et autre pour la dénaturation.

CONCLUSION:

CONCLUSION La LCR et la deuxième technique d’amplification géniques la plus publiée, après la PCR. Des études comparative montre que les performances de la LCR sont voisines de celles de la PCR.

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