BACTERIOCINA

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BACTERIOCINAS :

BACTERIOCINAS conservador en alimentos Listeria monocytogenes . Péptidos ó proteínas acción antimicrobiana

OBJETIVO:

OBJETIVO Evaluar el potencial probiotico de cepas de Lactobacillus acidophilus mediante la caracterización a la tolerancia de ácidos y bilis así como la producción de bacteriocinas por estas cepas in vitro .

CEPAS BACTERIANAS:

CEPAS BACTERIANAS LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA LACTEA L. delbrueckii subsp. lactis 4797 Y patógenas. Lactobacillus acidophilus 30SC ATCC LAB/ PATOGENAS MRS/TSB 37°C X 18h /37°C x 18-24 h

TOLERANCIA A LOS ÁCIDOS :

TOLERANCIA A LOS ÁCIDOS MRS PEPSINA Concentración de 1000 unid/ml. Incubadas a 37°C por 1, 2, y 3 h, 0.22- μ m

TOLERANCIA A LA BILIS :

TOLERANCIA A LA BILIS 37°C por 18 h en caldo MRS NaCl 0.85% MRS/0.3 acido biliares Incubar/37°C 48 h

PRODUCCIÓN Y ACTIVIDAD DE BACTERIOCINAS:

PRODUCCIÓN Y ACTIVIDAD DE BACTERIOCINAS (6,000 × g por 20 min, 4°C). pH 6.5 con 10 N NaOH 0.8% de Agar fue inoculado con 1% de la cepa indicadora, Leuconostoc sp Incubacion a 37°C por 24 h Medida de la zona de inhibición Screening de 5 cepas de Lactobacillus Para la producción de bacteriocinas (tabla 1)

SENSIBILIDAD AL CALOR, pH Y PROTEASAS:

SENSIBILIDAD AL CALOR, pH Y PROTEASAS Muestras de Bacteriocina Cruda Alícuotas de Bacteriocina semipurificada Ajustadas a pH 3 a 10 Muestras de bacteriocinas 37°C por 20 min y neutralizadas a pH 6 y probar actividad bacteriocina. Incubación de las bacteriocinas en presencia de pronasa E (1 mg/ml) y proteinasa K (1 mg/ml) a 37°C por 1 h. Inactivación por tratamiento de calor a 65°C x 30 min probar la actividad bacteriocina. 65°C x 40 min, 95°C x 20 min 121°C x 20 min, ) ,

PURIFICACIÓN DE BACTERIOCINA :

PURIFICACIÓN DE BACTERIOCINA 37°C por 24 h en caldo MRS 8,000 × g x 30 min, 4°C (NH 4 ) 2 SO 4 hasta 50% (wt/vol). Lactobacillus acidophilus Agitación a 4°C Resuspender con ácido sulfonico 2-(4-morfolina)-etano. Precipitado de (NH 4 ) 2 SO 4 Recolectado a 10,000 × g por 20 min

PURIFICACIÓN DE BACTERIOCINA:

PURIFICACIÓN DE BACTERIOCINA La solución de bacteriocina cruda fue colocada para la interacción hidrofobica con la columna cromatografica usando Sepharosa Octil CL-4B. La columna fue equilibrada con 1.7 M (NH 4 ) 2 SO 4 y entonces eluida con gradiente lineal usando H2O y etanol con una velocidad de flujo 1 ml/min. La absorbancia fue monitoreada a 280 nm y la actividad bacteriocina por cada fracción fue determinada por ensayo de spot on Lawn.

PAGE-SDS:

PAGE-SDS Gel fue lavado 3 veces en 250 ml de H2O por 30 minutos y el gel fue colocado sobre agar MRS y cubierto con MRS inoculado con 1% Leuconostoc sp. Fracciones activas de la columna de Sepharosa Octil fueron colectadas y concentradas Muestras 16.5% tricina-SDS con gel de poliacrilamida

RESULTADOS TOLERANCIA A LOS ACIDOS Y BILIS :

RESULTADOS TOLERANCIA A LOS ACIDOS Y BILIS Experimentos se repitieron 4 veces. Cada cuenta viable fue realizada por duplicado. Población alta de L. acidophilus sobrevivieron bajo condiciciones acidas . (figura 1) Lactobacillus acidophilus NCFM menos tolerante a los ácidos con una población final de 6.0 × 104 UFC/ml, mientras que la población de L. acidophilus 30SC y ATCC 43121 permanecieron casi constantes.

RESULTADOS TOLERANCIA A LOS ACIDOS Y BILIS:

RESULTADOS TOLERANCIA A LOS ACIDOS Y BILIS Las 5 cepas de L. acidophilus exhibieron excelente tolerancia a los ácidos biliares . (figura 2) Lactobacillus acidophilus ATCC 43121 mostró un incremento en el crecimiento en medio que contenía 0.3% de ácidos biliares después de 24 h de incubación mientras que L. acidophilus 30SC sobrevivió a niveles de 7.0 × 105 UFC/ml bajo las mismas condiciones.

ESPECTRO INHIBITORIO :

ESPECTRO INHIBITORIO Se encontró que solo L. acidophilus 30SC produce bacteriocinas que tienen actividad antimicrobiana contra algunas de las cepas indicadoras probadas (tabla 1) Las bacteriocinas producidas por L. acidophilus 30SC fueron capaces de inhibir el crecimiento de bacterias patógenas Gram positivas incluyendo Bacillus cereus ATCC 11778, Listeria ivanovii,and Staphylococcus aureus . Las bacteriocinas de L. acidophilus 30SC no inhibieron a las bacterias Gram negativa.

EFECTO DE ENZIMAS, PH Y CALOR SOBRE LA BACTERIOCINAS :

EFECTO DE ENZIMAS, PH Y CALOR SOBRE LA BACTERIOCINAS La Bacteriocina es sensible a pronasa E y Proteinasa K, pero la solución de bacteriocina tratada con catalasa no tuvo efecto sobre la actividad (tabla 2) se sugiere que la inhibición no es debida al H202 . La sustancia inhibitoria es la proteinasa La actividad no fue afectada por calentamiento arriba de los 95°C por 20 min., y el 50% de actividad permaneció después del tratamiento de calor a 121°C por 20 min. La bacteriocina producida por L. acidophilus 30SC fue estable a pH 6 y 7, y 50% de actividad permaneció después de la evaluación a varios valores de pH entre 3 y 10.

PURIFICACIÓN DE LA BACTERIOCINA :

PURIFICACIÓN DE LA BACTERIOCINA La mayoría de la actividad bacteriocina fue eluida a 60% etanol de Sepharosa Octil. La actividad antimicrobiana es hidrofobica natural. (figura 3). PAGE-SDS de las fracciones activas colectadas resultaron en una banda simple con una masa molecular estimada de 3.5 kDa. La incubación de gel de electroforesis sobre el agar con con la cepa indicador confirmaron la acción inhibitoria de la proteína correspondiente a la banda. (Figure 4).

DISCUSION DE RESULTADOS :

DISCUSION DE RESULTADOS Cepas de L. acidophilus exhiben mayor resistencia a los ácidos y bilis que otras bacterias acido lácticas. La tolerancia de las BAL es dependiente: composición de la membrana citoplasmática la cual es influenciada por el tipo de bacteria, medio de crecimiento, condiciones de incubación. Las cepas de L. acidophilus L. casei y L. plantarum mostraron sobrevivir a pH 3.0 o menos . Algunas son capaces de atravesar el estomago sin perder viabilidad. Correlación significativa entre experimentos, in vivo/ in vitro , la prueba de tolerancia a los ácidos con jugo gástrico artificial es frecuentemente usado para seleccionar las cepas probióticas,

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Las sales biliares son producidas en el hígado producto del catabolismo del colesterol. Los ácidos biliares constan de Acido chenodeoxiclorico, acido clorico y otros componentes secretados del intestino delgado el duodeno. Los ácidos biliares han mostrado una actividad inhibitoria mas grande que los ácidos orgánicos .

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LAB aisladas de el intestino no crecieron también en el medio que contenía 0.15% de ácidos biliares. Sin embargo LAB aisladas de fuentes intestinales tales como L. acidophilus y L. casei , son capaces de sobrevivir en presencia de bilis debido a su habilidad de desconjugar los ácidos biliares . Existe una correlación entre la resistencia la bilis y la habilidad de las LAB para inhabitar el tracto intestinal .

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Para prolongar la sobrevivencia de las cepas probióticas en el huésped, las BAL deberían tener la habilidad de colonizar el intestino. La adherencia y colonización son consideradas propiedades importantes para las cepas probióticas. La habilidad de los probióticos para establecerse en el tracto gastrointestinal debería ser incrementada al eliminar los competidores usando bacteriocionas. .

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Las bacteriocinas producidas por L. acidophilus 30SC tienen efectos antimicrobianos sobre bacterias Listeria, B. cereus y B. subtilis Las bacteriocinas pueden ser usadas potencialmente como aditivo en la industria de los alimentos.

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La perdida de actividad antimicrobiana seguida del tratamiento con proteinasa y pronasa E indicaron que el componente activo secretado extracelularmente por L. acidophilus 30SC fue proteínas naturales. Las bacteriocinas: lactacina 27, acidolina, pediocina A y pediocina PA-1 , fueron estables a un gran rango de pH . La estabilidad al calor y pH puede ser útil si la bacteriocina es usada como un agente antimicrobiano en alimentos fermentados o alimentos que presente un proceso térmico.

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La masa molecular de la bacteriocina de L. acidophilus 30SC fue estimada a 3.5 KDa, mientras que la bacteriocina acidocina 8912 and lactacina B reportaron 5.4 and 6.5 kDa, respectivamente.

CONCLUSIONES :

CONCLUSIONES L. acidophilus 30SC es tolerante a los ácidos y bilis, tambien produce sustancias antagonista. Estas características pueden ser de gran ventaja para el cultivo probiotico ya que permite la colonización y la competencia con patógenos en el ambiente gastrointestinal. La habilidad de sobrevivir a condiciones ácidas , resistencia bilis y la producción de bacteriocinas que es activo contra patógenos y microorganismos deterioradores contribuyen a la habilidad de L. acidophilus 30sc como cultivo probiotico que pueda tener aplicaciones potenciales en la producción de alimentos.

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GRACIAS POR SU ATENCION