CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Y FISH

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Y FISH:

CITOGENÉTICA CONVENCIONAL Y FISH Unidad de Genética – INEN Expositor: Int. TM. Jason Rosado Sandoval

¿ Qué es un cariotipo?:

¿ Qué es un cariotipo? Es el ordenamiento de los cromosomas de una célula metafásica de acuerdo a su morfología, tales como el tamaño, la relación de los brazos dependiendo de la constricción primaria, presencia de constricciones secundarias, etc. Es característico de cada especie, al igual que el número de cromosomas; el ser humano tiene 46 cromosomas en el núcleo de cada célula, organizados en 22 pares autosómicos y 1 par sexual (hombre XY y mujer XX).

La Citogenética:

La Citogenética Es el estudio, dentro del campo de la genética, de los cromosomas, su estructura, su herencia y del lugar donde se encuentran Citogenética Convencional Citogenética Molecular FISH clásico M-FISH SKY CGH Bandas Q Bandas R Bandas G Bandas C Bandas NOR Bandeo de Alta Resolución

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EVOLUCIÓN DE LA CITOGENÉTICA a, Jérôme Lejeune construyendo un cariotipo humano en su laboratorio de París (abril de 1966); c , Klaus Patau observando cromosomas en el Laboratory of Genetics de Madison

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Cultivo y cosecha de Sangre periférica

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Cariotipo Convencional

TIPOS DE BANDEO CROMOSÓMICO:

TIPOS DE BANDEO CROMOSÓMICO

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Bandas Q Bandas Q El primer método de tinción desarrollado Requiere un microscopio de fluorescencia Bandas Q brillantes = bandas G oscuras Demostrar la porcion distal Yq Regiones pericentromericas de 3 y 4 , y las regiones satelitales y pericen- troméricas de acrocén tricos muestran polimorfismo

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Bandas R Bandeo inverso o R ("reverso") Opuesto al bandeo G Útil para teñir los extremos distales de los cromosomas (deleciones o reorganizaciones distales)

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Bandas G Bandas G-pálidas DNA rico en GC Replicación temprana Muchos genes Bandas G-oscuras DNA rico en AT Replicación tardía Pocos genes

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Ideograma

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Bandas C Bandas C Tamaño de la región de heterocromatina constitutiva pericentroméricas Para 1,9,16 y brazos q del cromosoma Y. Polimorfismos. Inv. pericentromericas.

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Banda Método Características Q Tinción con quinacrina Bandas fluorescentes brillantes. G Tinción con Giemsa, luego de pre-tratamiento del cromosoma Las bandas G oscuras corresponden a las Q brillantes R Varias técnicas Patrón inverso al de las Q y G, útiles para definir los extremos de los cromosomas. T Varias técnicas Resaltan las regiones teloméricas. C Extracción de DNA/proteínas, tinción con Giemsa Resaltan las regiones centroméricas. NOR Tinción con plata Tiñen las regiones organizadoras del nucléolo (acrocéntricos en el hombre)

Trisomía parcial de 21q :

Trisomía parcial de 21q APLICACIONES

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Dx prenatal Trisomía 13 APLICACIONES

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ONCOLOGÍA LMC APLICACIONES

Leucemia Monocítica Aguda (M5):

Leucemia Monocítica Aguda (M5) ONCOLOGÍA APLICACIONES

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Ventajas 1- Permite ver al genoma entero en una sola vez. 2- Conveniente cuando se sospecha una anomalía específica (ejm. Ph’ en LMC) y como herramienta de Dx general para detectar el chr adicional. Anormalidades comúnmente vistos en la progresión de la enfermedad de LMC Desventajas 1- Detecta anormalidades estructurales grandes ( una banda = 6Mb de DNA ~ 150 genes ). 2- Necesita mucho trabajo y alta experiencia y habilidades por el operador Ventajas y desentajas de la Citogenética convencional

FISH:

FISH ¿ Qué es FISH? FISH es una técnica mixta de citogenética molecular que nos permite el diagnóstico rápido de anomalías cromosómicas en metafase o interfase. Utiliza para ello una sonda de ADN marcado

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PRINCIPIOS DE FISH

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PRINCIPIOS DE FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH):

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Incrementa la sensibilidad , especificidad , y resolución del análisis cromosómico. Las sondas de DNA marcados con fluorocromos son usados para detectar o confirmar genes o anormalidades cromosómicas que van más allá de la citogenética de rutina Metafase FISH Interfase FISH

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Metafase- FISH Interfase-FISH

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SONDAS CENTROMÉRICAS (CEP) SONDAS DE LOCUS ESPECÍFICO (LSI) SONDAS PAINTING (WCP) SONDA TELOMÉRICA (TEL) TIPOS DE SONDAS

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Centromérico Locus específico Pintado cromosómico TIPOS DE SONDAS FISH CONVENCIONAL

Sondas “Dual-fusion” Patrón normal:

Sondas “Dual-fusion” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase

Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca:

Sondas “Dual-fusion” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase

Sondas “Break-appart” Patrón normal:

Sondas “Break-appart” Patrón normal Núcleo en interfase Cromosomas en metafase

Sondas “Break-appart” Translocación recíproca:

Sondas “Break-appart” Translocación recíproca Núcleo en interfase Cromosomas en metafase

Detección de Trisomía y Determinación del sexo:

Detección de Trisomía y Determinación del sexo Sondas para cromosomas 13,18,21,X,Y y SRY. APLICACIONES

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46,XY Determin ación de probable c ar i ot i p o . Verde = X R ojo = Y APLICACIONES X- e Y- sondas centrom é ric as

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Mar cador e s un derivativ o del cromosoma X ; Posible C a ri ot i p o : 47,XX,der(X) Qué se debería concluir del hallazgo con FISH ? APLICACIONES X- sonda centrom é ric a – identifica ción de cromosoma pequeño supernumerario ( chr. Mar cador)

Oncología:

Oncología Sondas de locus únicos ( deleción o amplificación) P58 CLK-1 Locus (1p36). D7S486 (7q31). Retinoblastoma (13q14). P53 (17p13.1). Her-2/ neu (17q11.2-q12). APLICACIONES No Amplificado Amplificado FISH / HER 2

Oncología:

Oncología bcr/abl translocación t(9;22)(q34;q11.2). M-bcr/abl translocación t(9;22)(q34;q11.2). IGH/CCND1 translocación t(11;14)(q13;q32). PML/RARA translocación t(15;17)(q22;q21.1). TEL/AML1 translocación t(12;21)(p13;q22). APLICACIONES

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LMC – SONDA DE FUSIÓN t9;22(q34;q11) APLICACIONES

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NEGATIVO PARA FUSIÓN GÉNICA PML/RARA PML SONDA PML RARA SONDA RARA POSITIVO PARA FUSIÓN GÉNICA PML/RARA RARA PML PML/RARA PML/RARA APLICACIONES

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FISH normal FISH t(14;18) IgH 14 Bcl2 18 Fusión Translocación 14;18 Dual Fusion- Translocaciones APLICACIONES

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Normal Translocación en Bcl2 Bcl 2 Split Break appart - Translocaciones Translocación en Bcl2 APLICACIONES

FISH:

FISH Ventajas: La resolución es buena (› ~ 2mb). Puede ser aplicada a células en células en división como en no división. La técnica es confiable. La hibridación con múltiples sondas permite la detección de productos de translocación. Puede identificar un rango de mutaciones. Monitoreo periódico o enfermedad residual en MO. Desventajas : No puede detectar pequeñas mutaciones. Omite Uniparental disomías. Omite Inversiones. Sondas no están comercialmente disponibles para todos las regiones cromosómicas.

Cariotipación espectral ( SKY):

Cariotipación espectral ( SKY)

SKY:

SKY Ventajas: Mapeo de puntos de quiebre cromosómicos. Detección de translocaciones sutiles. Identificación de cromosomas marcadores, regiones homogéneamente pintadas,y cromosomas doble minute Caracterización de rearreglos complejos . Desventajas: Equipos muy costosos. La técnica es laboriosa. No se pueden detectar rearreglos cromosómicos con 1 sólo cromosoma. Baja resolución (mayor a 15 Mb ). Específico, pero no como método de screening .

Hibridación Genómica comparativa ( CGH):

Hibridación Genómica comparativa ( CGH)

CGH:

CGH Ventajas: Requiere sólo DNA genómico tumoral. Puede ser aplicado a tejidos frescos o congelados, lineas celulares, y muestras archivadas fijadas con formalina y parafinadas. Desventajas: No puede detectar anormalidades balanceadas. Copias de cambios cromosómicos < 10 mb. No son resueltos

¿ Cuando aplicar FISH?:

¿ Cuando aplicar FISH? Ausencia de tejido fresco Si se ha aplicado citogenética: • “Cariotipos normales” (linfocito T) • Metafases con cromosomas de mala calidad • Cariotipos muy complejos difíciles de definir

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CITOGENÉTICA • Requiere células en división • Requiere tejido fresco • Permite detectar alteraciones de todo el genoma • Bajo coste económico FISH • No requiere células en división • Permite estudiar material parafinado o congelado • Solo aporta información de la sonda que se utiliza • Moderado coste económico CITOGENÉTICA CONVENCIONAL vs FISH

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Muchas gracias...