Methodes de dosage immunologique

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Methodes de dosage immunologiqueouimmunochimie : 

Methodes de dosage immunologiqueouimmunochimie

Plan: 1-Introduction: 2- Généralités:3-Réaction Ag-Ac: caractéristiques. Facteurs influençant4-Anticorps polyclonaux et monoclonaux5- Différente classes des méthodes immunologique: Immunodosage sans marqueurs : précipitation: en milieu liquide. en milieu gélifié. Agglutination: agglut. directe agglut. indirecte agglut. passive: : 

Plan: 1-Introduction: 2- Généralités:3-Réaction Ag-Ac: caractéristiques. Facteurs influençant4-Anticorps polyclonaux et monoclonaux5- Différente classes des méthodes immunologique: Immunodosage sans marqueurs : précipitation: en milieu liquide. en milieu gélifié. Agglutination: agglut. directe agglut. indirecte agglut. passive:

Immunodosage avec marqueurs: propriétés d’un marqueur idéal différents type des marqueurs: marqueurs radio-isotopiques marqueurs enzymatiques marqueur fluorescents marqueurs luminescent méthodologie: méthodes par compétition . méthodes sandwich . Amplification et détection du signal: Problèmes des méthodes avec marqueurs. : 

Immunodosage avec marqueurs: propriétés d’un marqueur idéal différents type des marqueurs: marqueurs radio-isotopiques marqueurs enzymatiques marqueur fluorescents marqueurs luminescent méthodologie: méthodes par compétition . méthodes sandwich . Amplification et détection du signal: Problèmes des méthodes avec marqueurs.

Introduction : On regroupe sous le terme de méthode immunochimiques toutes les méthodes se basant sur la mise en évidence du complexe qui se forme lors de la réaction Ag – Ac. Il s’agit le plus souvent d’utiliser des Ac spécifiques pour identifier et éventuellement quantifier les Ag. L’utilisation de ce principe a donné naissance à une multitude de méthodes difficiles parfois à classer. : 

Introduction : On regroupe sous le terme de méthode immunochimiques toutes les méthodes se basant sur la mise en évidence du complexe qui se forme lors de la réaction Ag – Ac. Il s’agit le plus souvent d’utiliser des Ac spécifiques pour identifier et éventuellement quantifier les Ag. L’utilisation de ce principe a donné naissance à une multitude de méthodes difficiles parfois à classer.

Généralités: ◘ Antigène: substance susceptible d'induire la formation d'anticorps lorsqu'elle est introduite dans un organisme. Il porte plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes.Les épitopes d'un même antigène peuvent être tous identiques ou différents ♦Haptène: sont des antigènes incomplet.ils sont capable de se combiner spécifiquement à un anticorps. ils ne peuvent en déclencher l’ élaboration. ils induisent la synthèse des anticorps seulement lorsqu’ils sont couplées à une protéine. ♦La valence d’un Ag: représente le nombre de sites de fixation d’un anticorps (épitope).. : 

Généralités: ◘ Antigène: substance susceptible d'induire la formation d'anticorps lorsqu'elle est introduite dans un organisme. Il porte plusieurs déterminants antigéniques ou épitopes.Les épitopes d'un même antigène peuvent être tous identiques ou différents ♦Haptène: sont des antigènes incomplet.ils sont capable de se combiner spécifiquement à un anticorps. ils ne peuvent en déclencher l’ élaboration. ils induisent la synthèse des anticorps seulement lorsqu’ils sont couplées à une protéine. ♦La valence d’un Ag: représente le nombre de sites de fixation d’un anticorps (épitope)..

1- Antigène univalent et uni-déterminé: possède un seul épitope à la surface qui est capable de se lier à un anticorps. Les haptènes sont univalent et uni-déterminé. 2- Antigène multivalent et uni-déterminé : possède au moins deux épitopes du même type sur une molécule d’antigène. 3- Antigène multi-déterminé et univalent: présente plusieurs épitopes de différents types, mais seulement un de chaque type sur une molécule d’antigène. 4- Antigène multi-déterminé et multivalent: présente plusieurs épitopes de différents types et plus d’un épitope de chaque type par molécule d’antigène : 

1- Antigène univalent et uni-déterminé: possède un seul épitope à la surface qui est capable de se lier à un anticorps. Les haptènes sont univalent et uni-déterminé. 2- Antigène multivalent et uni-déterminé : possède au moins deux épitopes du même type sur une molécule d’antigène. 3- Antigène multi-déterminé et univalent: présente plusieurs épitopes de différents types, mais seulement un de chaque type sur une molécule d’antigène. 4- Antigène multi-déterminé et multivalent: présente plusieurs épitopes de différents types et plus d’un épitope de chaque type par molécule d’antigène

Anticorps: immunolobulines secrétées en réaction à la présence d’antigènes Ce sont des glycoprotéines qui ont une structure de base en forme de Y, dont les paratopes, spécifiques d'un antigène, sont variables d'un anticorps à l'autre : 

Anticorps: immunolobulines secrétées en réaction à la présence d’antigènes Ce sont des glycoprotéines qui ont une structure de base en forme de Y, dont les paratopes, spécifiques d'un antigène, sont variables d'un anticorps à l'autre

Structure: 2 chaines lourdes qui définissent 5 classes: IgG,IgM,IgA,IgD et IgE. 2 chaines légères : Kappa et LambdaLes chaine légères et lourdes sont liées entre eux par des pont disulfures S-S.Organisation en domaines:chaine légères: Un domaine variable : VL. Un domaine constant : CL.La chaîne lourde : 3 domaines constants : CH1, CH2, CH3. Un domaine variable : VH.Action des enzymes : si on fait subir l’Ig à la papaïne, on obtient 3 fragments :* 2 fragments Fab : chacun comporte : VH, CH1 + CL + VL.* un fragment Fc : CH2 + CH3 + CH2 + CH3. : 

Structure: 2 chaines lourdes qui définissent 5 classes: IgG,IgM,IgA,IgD et IgE. 2 chaines légères : Kappa et LambdaLes chaine légères et lourdes sont liées entre eux par des pont disulfures S-S.Organisation en domaines:chaine légères: Un domaine variable : VL. Un domaine constant : CL.La chaîne lourde : 3 domaines constants : CH1, CH2, CH3. Un domaine variable : VH.Action des enzymes : si on fait subir l’Ig à la papaïne, on obtient 3 fragments :* 2 fragments Fab : chacun comporte : VH, CH1 + CL + VL.* un fragment Fc : CH2 + CH3 + CH2 + CH3.

La réaction Ag-Ac résulte de la fixation d’un déterminant antigénique sur un site paratope de l’anticorps. Cette réaction est immédiate, spécifique et réversible .Dans le cas d’un Ag macromoléculaire(multivalent), il peut s’établir de nouvelles interactions entre les régions de l’Ag et de Ac . : 

La réaction Ag-Ac résulte de la fixation d’un déterminant antigénique sur un site paratope de l’anticorps. Cette réaction est immédiate, spécifique et réversible .Dans le cas d’un Ag macromoléculaire(multivalent), il peut s’établir de nouvelles interactions entre les régions de l’Ag et de Ac .

Caracteristiques de la reaction Ag-Ac :●La réaction d'association entre un Ag et un Ac correspondant met en jeu des liaisons non covalentes de faibles énergie, permettant la réversibilité de la réaction. ●Quatre types de forces sont mises en jeu dans la liaison Ag-Ac .Ce sont: forces électrostatiques ou ioniques. liaisons hydrogènes. Liaisons hydrophobes forces de Van der Waals ●la spécificité de la réaction est due à la complementarité structurale.elle est trés élevée mais pas absolue → Réaction croisée : 

Caracteristiques de la reaction Ag-Ac :●La réaction d'association entre un Ag et un Ac correspondant met en jeu des liaisons non covalentes de faibles énergie, permettant la réversibilité de la réaction. ●Quatre types de forces sont mises en jeu dans la liaison Ag-Ac .Ce sont: forces électrostatiques ou ioniques. liaisons hydrogènes. Liaisons hydrophobes forces de Van der Waals ●la spécificité de la réaction est due à la complementarité structurale.elle est trés élevée mais pas absolue → Réaction croisée

●Réactions croisées: réactivité d’un anticorps vis-à-vis d’un antigène différent de celui qui a suscité son apparition. : 

●Réactions croisées: réactivité d’un anticorps vis-à-vis d’un antigène différent de celui qui a suscité son apparition. Réaction croisée Anti-A Ab Ag A Anti-A Ab

●L’affinité est la force d’interaction entre un seul épitope et un paratope. Elle dépend du nombre et de la force des liaisons formées entre l’épitope et paratope.. L’affinité est quantifiée à travers la constante d’équilibre (Keq) pour la formation du complexe anticorps (Ac)-Antigéne (Ag): [Ag]+[Ac] ↔ [Ag-Ac] Affinité = Keq = [Ag-Ac]/[Ag][Ac] Valeurs typiques d’affinité pour des interactions anticorps-haptène: 10 à 10 M-1. Le renversement de la liaison Ag-ac peut seulement être accompli sous des conditions extrêmes de pH, force ionique, etc.… : 

●L’affinité est la force d’interaction entre un seul épitope et un paratope. Elle dépend du nombre et de la force des liaisons formées entre l’épitope et paratope.. L’affinité est quantifiée à travers la constante d’équilibre (Keq) pour la formation du complexe anticorps (Ac)-Antigéne (Ag): [Ag]+[Ac] ↔ [Ag-Ac] Affinité = Keq = [Ag-Ac]/[Ag][Ac] Valeurs typiques d’affinité pour des interactions anticorps-haptène: 10 à 10 M-1. Le renversement de la liaison Ag-ac peut seulement être accompli sous des conditions extrêmes de pH, force ionique, etc.… 12 3

●Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité. ●si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un agglutinat. : 

●Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité. ●si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un agglutinat.

Paramètres influençant la réaction Ag-AcPH: modifie l’ état d’ionisation des groupements de l’antigéne et de l’anticorps.La température: en général ↑ de l’affinité avec↑ de la temperature.Les forces ionique: diminution des liaisons Ag-Ac avec ↑ des forces ioniques. : 

Paramètres influençant la réaction Ag-AcPH: modifie l’ état d’ionisation des groupements de l’antigéne et de l’anticorps.La température: en général ↑ de l’affinité avec↑ de la temperature.Les forces ionique: diminution des liaisons Ag-Ac avec ↑ des forces ioniques.

Anticorps polyclonaux vs. Monoclonaux On peut identifier 2 types d’anticorps: des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux. Anticorps polyclonaux:- un mélange complexe d'immunoglobulines isolées du sérum sanguin; Ces anticorps reconnaissent une série d'épitopes différents du même antigène . Ils possèdent une large gamme de sélectivités et affinités. Ceci peut donner lieu à des réactivités croisées ou à des interférences dans un essai immunologique. : 

Anticorps polyclonaux vs. Monoclonaux On peut identifier 2 types d’anticorps: des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux. Anticorps polyclonaux:- un mélange complexe d'immunoglobulines isolées du sérum sanguin; Ces anticorps reconnaissent une série d'épitopes différents du même antigène . Ils possèdent une large gamme de sélectivités et affinités. Ceci peut donner lieu à des réactivités croisées ou à des interférences dans un essai immunologique.

On injecte à un animal un antigène.Celui-ci induira la formation d'anticorps . Le sérum contenant l'anticorps recherché est appelé antisérum. Il contient normalement plusieurs espèces d'anticorps différentes (environ une dizaine de clonotypes) dirigés contre plusieurs épitopes . : 

On injecte à un animal un antigène.Celui-ci induira la formation d'anticorps . Le sérum contenant l'anticorps recherché est appelé antisérum. Il contient normalement plusieurs espèces d'anticorps différentes (environ une dizaine de clonotypes) dirigés contre plusieurs épitopes .

Anticorps monoclonaux: anticorps spécifique d’un seul épitope produits grâce aux méthodes de la technologie des hybridomes (impliquant des cultures cellulaires) Ils se lient à un seul type d’ épitope .Les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques et possèdent des propriétés plus reproductibles. Ils sont les anticorps de choix pour les essais analytiques. : 

Anticorps monoclonaux: anticorps spécifique d’un seul épitope produits grâce aux méthodes de la technologie des hybridomes (impliquant des cultures cellulaires) Ils se lient à un seul type d’ épitope .Les anticorps monoclonaux sont plus spécifiques et possèdent des propriétés plus reproductibles. Ils sont les anticorps de choix pour les essais analytiques.

OBTENTION DES CELLULES : 

FUSION DES CELLULES SELECTION DES HYBRIDOMES ISOLEMENT DES HYBRIDOMES TEST DES HYBRIDOMES DÉROULEMENT DE LA PRODUCTION DES HYBRIDOMES OBTENTION DES CELLULES PRODUCTION DES HYBRIDOMES

OBTENTION DES CELLULES : 

UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES HGPRT-/TK- OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC L’ANTIGÈNE ÉTUDIÉ OBTENTION DES CELLULES FUSION

Thymidine Kinase : 

Hypoxanthine IMP GMP Synthése endogène TMP Thymidine HGPRT Aminoptérine Aminoptérine Thymidine Kinase AMP Milieu HAT : Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine

Slide 21: 

FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol) FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION FUSION DES CELLULES

SELECTIONDESHYBRIDOMES : 

Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser HYBRIDOME SELECTIONNE SELECTIONDESHYBRIDOMES MORT CELLULAIRE disparition aprés quelques divisions ISOLEMENT

ISOLEMENTDESHYBRIDOMES : 

Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit ISOLEMENTDESHYBRIDOMES

test sur le surnageant de chaque puit de la presence des anticorps monoclonauxpar la methode elisa du type d’anticorps produit par des methodes d’immunoprecipitation : 

test sur le surnageant de chaque puit de la presence des anticorps monoclonauxpar la methode elisa du type d’anticorps produit par des methodes d’immunoprecipitation TESTDESHYBRIDOMES

production par cultures cellulaires : 

CONSERVATION DES HYBRIDOMES production par cultures cellulaires Production dans les liquides d'ascites OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Amplification des hybridomes PRODUCTIONDESACM

Différente classes des méthodes immunologique: A-Immunodosage sans marqueurs : Observation directe des effets de la réaction Ag-AC : 

Différente classes des méthodes immunologique: A-Immunodosage sans marqueurs : Observation directe des effets de la réaction Ag-AC

A-1-Immunoprécipitation: Un immunoprécipité correspond à la formation d’un édifice multimoléculaire résultant de l’union spécifique entre de nombreux antigènes et de nombreux anticorps. L’antigène soluble et moléculaire mis en jeu est généralement une protéine ou un polyoside.Les réactions d’immuno- précipitation se déroulent en trois étapes :*Liaison de l’Ac au déterminant antigéniques*Formation d’un réseau par réarrangement des sites de liaison *Agrégation des réseaux et formation de précipité visible à l’oeil nu. : 

A-1-Immunoprécipitation: Un immunoprécipité correspond à la formation d’un édifice multimoléculaire résultant de l’union spécifique entre de nombreux antigènes et de nombreux anticorps. L’antigène soluble et moléculaire mis en jeu est généralement une protéine ou un polyoside.Les réactions d’immuno- précipitation se déroulent en trois étapes :*Liaison de l’Ac au déterminant antigéniques*Formation d’un réseau par réarrangement des sites de liaison *Agrégation des réseaux et formation de précipité visible à l’oeil nu.

Caractéristiques: Ag: soluble Ac: précipitine ou Ac polyclonaux réseaux tridimensionnel (zone d’équivalence) lecture :œil nu turbidimétrie, néphélémétrie : 

Caractéristiques: Ag: soluble Ac: précipitine ou Ac polyclonaux réseaux tridimensionnel (zone d’équivalence) lecture :œil nu turbidimétrie, néphélémétrie

Zone d’équivalence: : 

anticorps++ antigène ++ équivalence Précipitation Zone d’équivalence: anticorps + antigène +++ anticorps+++ antigène +

Slide 31: 

La zone d'équivalence (est le point où la courbe atteint son maximum) correspond à la formation d'un réseau Ag-Ac

Méthodologie:Précipitation en milieu liquide: Test de l'anneau ( ring test ) Néphélémétrie Turbidimétrie Précipitation en milieu gélifié Immunodiffusion en tube de Oudin Immunodiffusion radial:Mancini Immunodiffusion double:Ouchterlony Électro-immunodiffusion de Laurell Immunoélectrophorèse Electrocenerese Immunofixation : 

Méthodologie:Précipitation en milieu liquide: Test de l'anneau ( ring test ) Néphélémétrie Turbidimétrie Précipitation en milieu gélifié Immunodiffusion en tube de Oudin Immunodiffusion radial:Mancini Immunodiffusion double:Ouchterlony Électro-immunodiffusion de Laurell Immunoélectrophorèse Electrocenerese Immunofixation

1-Précipitation en milieu liquide:● Test de l'anneau ( ring test )C'est un test qualitatif. On introduit dans un tube desantigènes et des anticorps et on laisse reposer. Ils vontlentement diffuser dans le milieu, créant des gradients deconcentration. Lorsqu'ils sont à l'équivalence, c'est-à-direqu'il y a autant de paratope que d'épitopes, ils forment descomplexes et précipitent. : 

1-Précipitation en milieu liquide:● Test de l'anneau ( ring test )C'est un test qualitatif. On introduit dans un tube desantigènes et des anticorps et on laisse reposer. Ils vontlentement diffuser dans le milieu, créant des gradients deconcentration. Lorsqu'ils sont à l'équivalence, c'est-à-direqu'il y a autant de paratope que d'épitopes, ils forment descomplexes et précipitent.

●Immunoturbidimetrie: la quantité de complexes Ag-Ac en solution est évaluée en mesurant la diminution de l’intensité de la lumière incidente. L’adition e PEG au milieu réactionnel permet d’ accélèrer la réaction et d’abaissé le seuil de détection. ▪Avantage: réalisé sur un simple spectrophotomètre ▪Inconvenant: concentration relativement élevé de réactif ▪Application: dosage α1microglobuline, CRP, Albumine, transferrine, haptoglobine,β2 microglobuline, les apoprotéine, LDL-chol. ▪Sensibilité: 5mg/l : 

●Immunoturbidimetrie: la quantité de complexes Ag-Ac en solution est évaluée en mesurant la diminution de l’intensité de la lumière incidente. L’adition e PEG au milieu réactionnel permet d’ accélèrer la réaction et d’abaissé le seuil de détection. ▪Avantage: réalisé sur un simple spectrophotomètre ▪Inconvenant: concentration relativement élevé de réactif ▪Application: dosage α1microglobuline, CRP, Albumine, transferrine, haptoglobine,β2 microglobuline, les apoprotéine, LDL-chol. ▪Sensibilité: 5mg/l

●Immunonéphélométrie : la déviation de la lumière dans un précipité dépend de sa concentration. On peut alors doser les antigènes ou les anticorps par un néphélométrie. Avantage: La consommation de réactif est inferieur à celle de la turbidimétrie Application: Ig, complément, facteur rhumatoïde et les haptènes ( médicaments). Sensibilité: 0.5g/l : 

●Immunonéphélométrie : la déviation de la lumière dans un précipité dépend de sa concentration. On peut alors doser les antigènes ou les anticorps par un néphélométrie. Avantage: La consommation de réactif est inferieur à celle de la turbidimétrie Application: Ig, complément, facteur rhumatoïde et les haptènes ( médicaments). Sensibilité: 0.5g/l

2-Precipitation en milieu gelifié: : 

2-Precipitation en milieu gelifié: Technique où Ac et Ag diffusent dans le milieu gélifié. La précipitation est obtenue dans la région du gel où Ag/Ac se trouvent dans des proportions permettant la formation du réseau. Appliquées à l'analyse qualitative d'un mélange d'Ag dans une solution Et au dosage immunochimique d'un Ag.

Les gels utilisés ce sont des gels d’Agarose: *Inertes chimiquement. * Visqueux à 50°C ce qui permet d’inclure Ag et Ac sans qu’ils soient dénaturés. *Solides à 37°C. *Transparents, permettant l’observation des précipités. : 

Les gels utilisés ce sont des gels d’Agarose: *Inertes chimiquement. * Visqueux à 50°C ce qui permet d’inclure Ag et Ac sans qu’ils soient dénaturés. *Solides à 37°C. *Transparents, permettant l’observation des précipités.

●Technique historique d'immunodiffusion en tube de Oudin Elle n'est pratiquement plus utilisée. Elle consiste à couler dans un tube une solution d'agar contenant un antisérum et de déposer sur l'agar après gélification une solution d'Ag qui diffusera dans le gel formant un gradient de concentration. La précipitation a lieu à l'endroit où les concentrations en Ag et Ac correspondent à la zone d'équivalence. : 

●Technique historique d'immunodiffusion en tube de Oudin Elle n'est pratiquement plus utilisée. Elle consiste à couler dans un tube une solution d'agar contenant un antisérum et de déposer sur l'agar après gélification une solution d'Ag qui diffusera dans le gel formant un gradient de concentration. La précipitation a lieu à l'endroit où les concentrations en Ag et Ac correspondent à la zone d'équivalence.

●Immunodiffusion radial:Mancini •L'anticorps est inclus dans le gel encore chaud et coulé sur une boîte de Pétri ou plaque en verre. •Dans des puits creusés dans l'agarose, on dépose des quantités connues de l'antigène, ainsi que l'antigène à doser. •Ag diffuse et forme avec l’Ac des anneaux de précipitation dans le diamètre est proportionnel a la concentration de l’Ag a dosé . •Donc l'établissement d'une courbe étalon à partir de solutions contenant des concentrations connues et croissantes d'Ag permet de préciser la concentration d'une solution inconnue du même Ag par la simple mesure du diamètre du cercle de précipitation. Cette méthode est éventuellement applicable aux Ac. : 

●Immunodiffusion radial:Mancini •L'anticorps est inclus dans le gel encore chaud et coulé sur une boîte de Pétri ou plaque en verre. •Dans des puits creusés dans l'agarose, on dépose des quantités connues de l'antigène, ainsi que l'antigène à doser. •Ag diffuse et forme avec l’Ac des anneaux de précipitation dans le diamètre est proportionnel a la concentration de l’Ag a dosé . •Donc l'établissement d'une courbe étalon à partir de solutions contenant des concentrations connues et croissantes d'Ag permet de préciser la concentration d'une solution inconnue du même Ag par la simple mesure du diamètre du cercle de précipitation. Cette méthode est éventuellement applicable aux Ac.

inconvénient : devoir attendre au moins 18 heures pour que le précipité se forme, de plus la précision de la méthode est faible.Sensibilité: 50mg/l : 

inconvénient : devoir attendre au moins 18 heures pour que le précipité se forme, de plus la précision de la méthode est faible.Sensibilité: 50mg/l

●Immunodiffusion (ou double diffusion) en plaque d'Ouchterlony •L'agar est coulé soit en boîte de Pétri, soit sur lames de verre et ne contient initialement ni Ag ni Ac. •Dans un deuxième temps, des puits creusés dans le gel servent de réservoirs les uns pour des solutions d'Ag et les autres pour des sérums immuns. •Dans la zone de rencontre de l'antigène avec l'anticorps(zone d'équivalence), il se forme un arc de précipité au bout de 24 à 48 heures. : 

●Immunodiffusion (ou double diffusion) en plaque d'Ouchterlony •L'agar est coulé soit en boîte de Pétri, soit sur lames de verre et ne contient initialement ni Ag ni Ac. •Dans un deuxième temps, des puits creusés dans le gel servent de réservoirs les uns pour des solutions d'Ag et les autres pour des sérums immuns. •Dans la zone de rencontre de l'antigène avec l'anticorps(zone d'équivalence), il se forme un arc de précipité au bout de 24 à 48 heures.

Dans un mélange antigénique complexe, cette méthode permet :•de dénombrer le nombre d'antigènes. Chaque arc correspond à au moins un antigène;•de comparer des antigènes déposés dans des puits contigus. Si les deux antigènes sont identiques on obtient une réaction d'identité, les deux arcs se rejoignent et sont en continuité .S'ils sont différents, les deux arcs se croisent, il y a non-identité. Si les deux antigènes ont en commun certains épitopes, et que l'un des antigènes a des épitopes supplémentaires, on observe une réaction d'identité partielle. : 

Dans un mélange antigénique complexe, cette méthode permet :•de dénombrer le nombre d'antigènes. Chaque arc correspond à au moins un antigène;•de comparer des antigènes déposés dans des puits contigus. Si les deux antigènes sont identiques on obtient une réaction d'identité, les deux arcs se rejoignent et sont en continuité .S'ils sont différents, les deux arcs se croisent, il y a non-identité. Si les deux antigènes ont en commun certains épitopes, et que l'un des antigènes a des épitopes supplémentaires, on observe une réaction d'identité partielle.

●Électro-immunodiffusion de Laurell ou électrophorèse en fusée (rocket) Proche de la technique de Mancini, la diffusion de l'antigène est accélérée par un champ électrique. La migration se fait dans une seule direction, et le précipité ressemble à une fusée (rocket) ou à une flamme .La hauteur du précipité est proportionnelle à la concentration de l'antigène. Des facteurs de la coagulation sont dosés par cette méthode. Le résultat est accessible en quelques heures. : 

●Électro-immunodiffusion de Laurell ou électrophorèse en fusée (rocket) Proche de la technique de Mancini, la diffusion de l'antigène est accélérée par un champ électrique. La migration se fait dans une seule direction, et le précipité ressemble à une fusée (rocket) ou à une flamme .La hauteur du précipité est proportionnelle à la concentration de l'antigène. Des facteurs de la coagulation sont dosés par cette méthode. Le résultat est accessible en quelques heures.

●Immunoélectrophorèse Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilitéélectrophorétique et leur spécificité antigénique. : 

●Immunoélectrophorèse Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes, leur mobilitéélectrophorétique et leur spécificité antigénique.

•Dans un premier temps, les molécules antigéniques sont séparées grâce à leur différence de mobilité dans un champ électrique. •Dans un deuxième temps, lorsque la séparation est jugée suffisante, un antisérum est placé dans une rigole parallèle au sens de migration des Ag. •Ag et Ac diffusent librement dans le gel et donnent des arcs de précipitation selon le même principe que l'immunodiffusion d'Ouchterlony.. : 

•Dans un premier temps, les molécules antigéniques sont séparées grâce à leur différence de mobilité dans un champ électrique. •Dans un deuxième temps, lorsque la séparation est jugée suffisante, un antisérum est placé dans une rigole parallèle au sens de migration des Ag. •Ag et Ac diffusent librement dans le gel et donnent des arcs de précipitation selon le même principe que l'immunodiffusion d'Ouchterlony..

Cette technique est hautement discriminative et a permis la mise en évidence de plus de 30 molécules antigéniques différentes dans le sérum humain en utilisant comme Ac un sérum animal antisérum humain. Par ailleurs, elle se prête à une étude semi-quantitative des concentrations d'Ag et permet de préciser la classe et la sous-classe des Ig monoclonales. : 

Cette technique est hautement discriminative et a permis la mise en évidence de plus de 30 molécules antigéniques différentes dans le sérum humain en utilisant comme Ac un sérum animal antisérum humain. Par ailleurs, elle se prête à une étude semi-quantitative des concentrations d'Ag et permet de préciser la classe et la sous-classe des Ig monoclonales.

●Contre-immunoélectrophorèse ou électrocinérèse. Dans certains systèmes et en choisissant judicieusement les conditions physico-chimiques de la migration dans un champ électrique, il est possible de faire migrer l'Ag dans un sens et les Ac de l'immunsérum dans le sens opposé. Ag et Ac migrent alors rapidement à la rencontre l'un de l'autre. Au niveau des zones d'équivalence, la réaction Ag-Ac conduit à la formation d'un arc de précipitation. Cette technique a été proposée au début pour la détection de l'Ag associé à l'hépatite B (Ag HBs) ou celle des Ac correspondants, ainsi que pour la mise en évidence d'auto-Ac spécifiques de différents Ag solubles du noyau. : 

●Contre-immunoélectrophorèse ou électrocinérèse. Dans certains systèmes et en choisissant judicieusement les conditions physico-chimiques de la migration dans un champ électrique, il est possible de faire migrer l'Ag dans un sens et les Ac de l'immunsérum dans le sens opposé. Ag et Ac migrent alors rapidement à la rencontre l'un de l'autre. Au niveau des zones d'équivalence, la réaction Ag-Ac conduit à la formation d'un arc de précipitation. Cette technique a été proposée au début pour la détection de l'Ag associé à l'hépatite B (Ag HBs) ou celle des Ac correspondants, ainsi que pour la mise en évidence d'auto-Ac spécifiques de différents Ag solubles du noyau. Ac Ag + -

●Immunofixation: L‘ immunofixation est une technique immunologique permettant de mettre en évidence et de préciser le typage d'une immunoglobuline monoclonale (myélome…)Technique qui associe une électrophorèse à une immunoprécipitation in situ, suivit d’une coloration. Méthode plus sensible et plus rapide que l'immunoélectrophorèse. : 

●Immunofixation: L‘ immunofixation est une technique immunologique permettant de mettre en évidence et de préciser le typage d'une immunoglobuline monoclonale (myélome…)Technique qui associe une électrophorèse à une immunoprécipitation in situ, suivit d’une coloration. Méthode plus sensible et plus rapide que l'immunoélectrophorèse.

Principe: La première étape consiste à déposer les antigènes contenus dans le plasma sur un gel, puis de séparer ces antigènes en fonction de leur mobilité électrophorétique en les faisant migrer sous l’effet d’un champ électrique. La deuxième étape nécessite de faire migrer le sérum testé plusieurs fois. Pour cela les anticorps ne sont pas déposés dans une rigole, comme dans l‘immunoélectrophorèse, mais sont ajoutés individuellement sur chaque piste de migration des différents Ag. : 

Principe: La première étape consiste à déposer les antigènes contenus dans le plasma sur un gel, puis de séparer ces antigènes en fonction de leur mobilité électrophorétique en les faisant migrer sous l’effet d’un champ électrique. La deuxième étape nécessite de faire migrer le sérum testé plusieurs fois. Pour cela les anticorps ne sont pas déposés dans une rigole, comme dans l‘immunoélectrophorèse, mais sont ajoutés individuellement sur chaque piste de migration des différents Ag.

A-2:Agglutination: 1 – Principe: Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situe a la surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes, micro-organismes, billes de latex ou de sépharose). C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion en amas. : 

A-2:Agglutination: 1 – Principe: Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situe a la surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes, micro-organismes, billes de latex ou de sépharose). C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion en amas.

Les paramètres de réaction Les Ac dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables deproduire une agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [Na Cl] = 0,15 M. dits non-agglutinants sont incapables de provoquer uneagglutination dans ces conditions (IgG). Les Ag : il existe une relation entre l’ agglutinabilité et :- le nombre de sites antigéniques.- leur localisation . L’agglutination est utilisée comme un test qualitatif de la présence d’anticorps dans le sérum sanguin et pour déterminer le groupe sanguin. : 

Les paramètres de réaction Les Ac dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables deproduire une agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [Na Cl] = 0,15 M. dits non-agglutinants sont incapables de provoquer uneagglutination dans ces conditions (IgG). Les Ag : il existe une relation entre l’ agglutinabilité et :- le nombre de sites antigéniques.- leur localisation . L’agglutination est utilisée comme un test qualitatif de la présence d’anticorps dans le sérum sanguin et pour déterminer le groupe sanguin.

Les facteurs influençants ;- La température: plus elle est élevée plus l’agitation moléculaireest importante (augmentation de rencontre).L’agglutination est plusrapide a 37°C, cependantla quantité finale d’Acfixes est plus élevée abasse température (après24 h). On distingue desAc ≪ chauds ≫ et des Ac≪ froids ≫.- Le pH: optimum entre 6 et 8- Les forces ioniques: (effet quasi nul), elle contrarie l’union Ag-Acmais favorise la formation du réseau. : 

Les facteurs influençants ;- La température: plus elle est élevée plus l’agitation moléculaireest importante (augmentation de rencontre).L’agglutination est plusrapide a 37°C, cependantla quantité finale d’Acfixes est plus élevée abasse température (après24 h). On distingue desAc ≪ chauds ≫ et des Ac≪ froids ≫.- Le pH: optimum entre 6 et 8- Les forces ioniques: (effet quasi nul), elle contrarie l’union Ag-Acmais favorise la formation du réseau.

1-Agglutination directe:Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre a la particule. Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame et peut être qualitatives ou quantitatives. : 

1-Agglutination directe:Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre a la particule. Elle peut se faire en tubes, en microplaques ou sur lame et peut être qualitatives ou quantitatives.

Application:→ Serogroupages bacteriens (Salmonella, Shigella, E. coli, enterophathogenes…): : 

Application:→ Serogroupages bacteriens (Salmonella, Shigella, E. coli, enterophathogenes…):

→Groupage sanguin ABO : : 

→Groupage sanguin ABO :

Agglutination indirecte: dans se cas l’ antigène est adsorbé ou fixé grâce à un procédé chimique (glutaraldéhyde) sur une particule (globules rouges ou, plus récemment, sur des particules inertes (latex, polystyrène). : 

Agglutination indirecte: dans se cas l’ antigène est adsorbé ou fixé grâce à un procédé chimique (glutaraldéhyde) sur une particule (globules rouges ou, plus récemment, sur des particules inertes (latex, polystyrène).

Application: •diagnostic des anémies hémolytiques auto-immunes (coombs direct et indirect) •Détection des facteurs rhumatoïdes : réaction de latex et Waaler-Rose. •Détection des autoanticorps antithyroïdiens : thyroperoxydase, thyroglobuline. •Diagnostic de la syphilis treponema pallidum hemagglutination (TPHA) et veneral disease research laboratory (VDRL). •Détection d'anticorps dans :les infections virales : cytomégalovirus, rubéole, mononucléose les infections bactériennes : streptocoque, mycoplasme;les infections fongiques : Candida ;les infections parasitaires : toxoplasmose. : 

Application: •diagnostic des anémies hémolytiques auto-immunes (coombs direct et indirect) •Détection des facteurs rhumatoïdes : réaction de latex et Waaler-Rose. •Détection des autoanticorps antithyroïdiens : thyroperoxydase, thyroglobuline. •Diagnostic de la syphilis treponema pallidum hemagglutination (TPHA) et veneral disease research laboratory (VDRL). •Détection d'anticorps dans :les infections virales : cytomégalovirus, rubéole, mononucléose les infections bactériennes : streptocoque, mycoplasme;les infections fongiques : Candida ;les infections parasitaires : toxoplasmose.

Slide 59: 

Test de Coombs direct

Remarque: L’agglutination indirecte peut être réalisé entre un anticorps non agglutinant et un antigène faisant normalement partie intégrante de la particule, en faisant appel à un artifice: On établit un pontage spécifique par des anti-globulines qui, en s’unissant aux anticorps non agglutinant provoque l’agglutination. : 

Remarque: L’agglutination indirecte peut être réalisé entre un anticorps non agglutinant et un antigène faisant normalement partie intégrante de la particule, en faisant appel à un artifice: On établit un pontage spécifique par des anti-globulines qui, en s’unissant aux anticorps non agglutinant provoque l’agglutination.

Test de coombs direct: : 

Test de coombs direct: Test de Coombs indirect.

B-Immunodosage avec marqueur: La liaison de l'Ac à l'Ag est objectivée par différentes méthodes utilisant le marquage direct des Ac ou des Ag de la réaction Ag-Ac ou celui indirect des Ac marqués dirigés contre des Ac de la réaction Ag-Ac . Les Ag marqués permettent de localiser les Ac là où ils se trouvent et les Ac marqués servent à identifier in situ les Ag et à effectuer des dosages d'Ag ou d'Ac.Ces techniques comportent une étape de reconnaissance immunologique, suivie de la mesure du signal émis par le marqueur, ce dernier pouvant être fixé aussi bien à l'antigène qu'à l'anticorps : 

B-Immunodosage avec marqueur: La liaison de l'Ac à l'Ag est objectivée par différentes méthodes utilisant le marquage direct des Ac ou des Ag de la réaction Ag-Ac ou celui indirect des Ac marqués dirigés contre des Ac de la réaction Ag-Ac . Les Ag marqués permettent de localiser les Ac là où ils se trouvent et les Ac marqués servent à identifier in situ les Ag et à effectuer des dosages d'Ag ou d'Ac.Ces techniques comportent une étape de reconnaissance immunologique, suivie de la mesure du signal émis par le marqueur, ce dernier pouvant être fixé aussi bien à l'antigène qu'à l'anticorps

Propriétés d’un marqueur idéal: de multiples liaisons covalentes au réactif (antigène ou anticorps) pour une haute sensibilité. l’espèce marquée doit être stable. le marquage doit avoir un effet minimal sur les propriétés de liaison de l’antigène et del’anticorps. le marqueur est facilement détectable avec une instrumentation peu coûteuse et automatisée. le marqueur possède des propriétés qui permettent de différentier entre une espèce libre et une espèce liée sans une étape de séparation. : 

Propriétés d’un marqueur idéal: de multiples liaisons covalentes au réactif (antigène ou anticorps) pour une haute sensibilité. l’espèce marquée doit être stable. le marquage doit avoir un effet minimal sur les propriétés de liaison de l’antigène et del’anticorps. le marqueur est facilement détectable avec une instrumentation peu coûteuse et automatisée. le marqueur possède des propriétés qui permettent de différentier entre une espèce libre et une espèce liée sans une étape de séparation.

Différents types de marqueurs: marqueurs radio-isotopes marqueurs enzymatiques marqueurs fluorophores marqueurs luminescent : 

Différents types de marqueurs: marqueurs radio-isotopes marqueurs enzymatiques marqueurs fluorophores marqueurs luminescent

1-Marquage par un isotope radioactif (RA*) Il existe deux types de marquage : in vivo et in vitro. -a- Marquage in vivo Par adjonction de précurseurs contenant des isotopes radioactifs (acides aminés, sucres, bases, etc...) à des cultures cellulaires ou bactériennes. Cela permet d'obtenir des molécules biologiques radiomarquées (RA*) non modifiées dans leur conformation ayant donc une grande identité de propriétés biochimiques et biologiques avec la molécule "naturelle" en particulier pour les propriétés immunologiques (Ag ou Ac). : 

1-Marquage par un isotope radioactif (RA*) Il existe deux types de marquage : in vivo et in vitro. -a- Marquage in vivo Par adjonction de précurseurs contenant des isotopes radioactifs (acides aminés, sucres, bases, etc...) à des cultures cellulaires ou bactériennes. Cela permet d'obtenir des molécules biologiques radiomarquées (RA*) non modifiées dans leur conformation ayant donc une grande identité de propriétés biochimiques et biologiques avec la molécule "naturelle" en particulier pour les propriétés immunologiques (Ag ou Ac).

Marquage in vitro * Par remplacement d'un des atomes "naturels" de la molécule par un isotope RA* tel que le tritium H ou le phosphore *Par introduction d'un atome nouveau RA* comme dans le marquage par l'iode 131 ou 125 : L'iode est fixé artificiellement sur l'Ag ou l'Ac, principalement au niveau des résidus tyrosine des protéines (radical aminé) en faisant apparaître dans le milieu réactif des ions I* qui se substituent aux H des molécules à marquer. : 

Marquage in vitro * Par remplacement d'un des atomes "naturels" de la molécule par un isotope RA* tel que le tritium H ou le phosphore *Par introduction d'un atome nouveau RA* comme dans le marquage par l'iode 131 ou 125 : L'iode est fixé artificiellement sur l'Ag ou l'Ac, principalement au niveau des résidus tyrosine des protéines (radical aminé) en faisant apparaître dans le milieu réactif des ions I* qui se substituent aux H des molécules à marquer. 3 32

Avantages: faible encombrement stérique. Rapides. Reproductibles. très précises.Inconvénient: matériel radioactif. risque de réaction croisée.Application: dosage des auto-Ac anti DNA dans le lupus dosage hormonaux recherche des IgE spécifiques et totales : 

Avantages: faible encombrement stérique. Rapides. Reproductibles. très précises.Inconvénient: matériel radioactif. risque de réaction croisée.Application: dosage des auto-Ac anti DNA dans le lupus dosage hormonaux recherche des IgE spécifiques et totales

2-Marquage par une enzyme l'enzyme est utilisée comme marqueur par association à l'aide de liaisons covalentes ou non avec l'Ag ou l'Ac . L'agent chimique de couplage entre l'enzyme d'une part et l'Ag ou l'Ac d'autre part, ne doit pas modifier de façon notable l'activité de l'une ou de l'autre. : 

2-Marquage par une enzyme l'enzyme est utilisée comme marqueur par association à l'aide de liaisons covalentes ou non avec l'Ag ou l'Ac . L'agent chimique de couplage entre l'enzyme d'une part et l'Ag ou l'Ac d'autre part, ne doit pas modifier de façon notable l'activité de l'une ou de l'autre.

2-a:Méthodes de couplage : *couplage par le glutaraldéhyde Le glutaraldéhyde est un aldéhyde dont les fonctions CHO se lient aux groupements aminés des lysines de l'enzyme, l'Ac ou l'Ag. : 

2-a:Méthodes de couplage : *couplage par le glutaraldéhyde Le glutaraldéhyde est un aldéhyde dont les fonctions CHO se lient aux groupements aminés des lysines de l'enzyme, l'Ac ou l'Ag.

*Couplage par la dimaléimide Les groupements imides réagissent avec les groupements thiols (-SH) des protéines (Ag ou Ac) et avec ceux de l'enzyme. : 

*Couplage par la dimaléimide Les groupements imides réagissent avec les groupements thiols (-SH) des protéines (Ag ou Ac) et avec ceux de l'enzyme.

*Couplage par le toluène 2-4-di-isocyanate * couplage par le système avidine-biotine: : 

*Couplage par le toluène 2-4-di-isocyanate * couplage par le système avidine-biotine:

2-b:Enzymes utilisées comme marqueurs et leur substrat: Phosphatase alcaline d'Escherichia coli Le substrat habituel est le paranitrophényl phosphate (PNPP ) qui donne le paranitrophénol (PNP) coloré en jaune révélé par colorimétrie a 405 nm. : 

2-b:Enzymes utilisées comme marqueurs et leur substrat: Phosphatase alcaline d'Escherichia coli Le substrat habituel est le paranitrophényl phosphate (PNPP ) qui donne le paranitrophénol (PNP) coloré en jaune révélé par colorimétrie a 405 nm.

Galactosidase :le substrat est le galactoside qui donne le 2-nitrophénol coloré en jaune et révélé par colorimétrie G6-Pdéshydrogénase:substrat G6-P et NAD+ pour libérer le NADH,H+ qui est révélé par spectrométrie UV à 340nm. : 

Galactosidase :le substrat est le galactoside qui donne le 2-nitrophénol coloré en jaune et révélé par colorimétrie G6-Pdéshydrogénase:substrat G6-P et NAD+ pour libérer le NADH,H+ qui est révélé par spectrométrie UV à 340nm.

Peroxydase du Raifort: H2O2 + OPD (orthophényléne diamine) →Produit coloré (orange)H2O2 + luminol →Produit luminescent . : 

Peroxydase du Raifort: H2O2 + OPD (orthophényléne diamine) →Produit coloré (orange)H2O2 + luminol →Produit luminescent .

Avantages: pas de risques liés à la radio activité. Automatisable. La plus utilisé remplaçant la radio-immunologie .Inconvénients: dépond des conditions opératoire. Signal faible. : 

Avantages: pas de risques liés à la radio activité. Automatisable. La plus utilisé remplaçant la radio-immunologie .Inconvénients: dépond des conditions opératoire. Signal faible.

3-Marquage par un fluorochrome :Les fluorochromes les plus utilisés et la couleur de leur fluorescence sont : -Isothiocyanate de fluorescéine = fluorescence verte -phycoérythrine = fluorescence rouge. -isothiocyanate de rhodamine, acide sulfonique de rhodamine et rouge Texas = fluorescence rouge-orangé, -acide sulfonique du 1 diméthyl aminonaphtalène = fluorescence rouge. : 

3-Marquage par un fluorochrome :Les fluorochromes les plus utilisés et la couleur de leur fluorescence sont : -Isothiocyanate de fluorescéine = fluorescence verte -phycoérythrine = fluorescence rouge. -isothiocyanate de rhodamine, acide sulfonique de rhodamine et rouge Texas = fluorescence rouge-orangé, -acide sulfonique du 1 diméthyl aminonaphtalène = fluorescence rouge.

Avantages: marquage facile. traceur stable.Méthode de marquage:Ces fluorochromes se couplent spontanément aux protéines à pH alcalin grâce à leur fonction isothiocyanate ou acide sulfonique. : 

Avantages: marquage facile. traceur stable.Méthode de marquage:Ces fluorochromes se couplent spontanément aux protéines à pH alcalin grâce à leur fonction isothiocyanate ou acide sulfonique.

Les marqueurs chimiluminescents Les marqueurs chimiluminescents émettent de la lumière après absorption d'énergie chimique. Les principauxmarqueurs ou systèmes utilisés sont : - les phtalhydrazides (luminol, isoluminol et dérivés), - les esters d'acridinium, - le système phosphatase alcaline-AMPPD (adamantyl méthoxy-phénylphosphate dioxétane), - le système luciférine-luciférase.Ils sont détectés par luminométrie : 

Les marqueurs chimiluminescents Les marqueurs chimiluminescents émettent de la lumière après absorption d'énergie chimique. Les principauxmarqueurs ou systèmes utilisés sont : - les phtalhydrazides (luminol, isoluminol et dérivés), - les esters d'acridinium, - le système phosphatase alcaline-AMPPD (adamantyl méthoxy-phénylphosphate dioxétane), - le système luciférine-luciférase.Ils sont détectés par luminométrie

Avantages : stabilité, signal très spécifique (pas de lumière parasite), acquisition rapide et grande dynamique dusignal. Inconvénients : nécessité de posséder un luminomètre, signal souvent fugace (imprécision de la mesure),atténuation (« quenching ») possible. : 

Avantages : stabilité, signal très spécifique (pas de lumière parasite), acquisition rapide et grande dynamique dusignal. Inconvénients : nécessité de posséder un luminomètre, signal souvent fugace (imprécision de la mesure),atténuation (« quenching ») possible.

Méthodologie: des immunodosages peuvent être classés en deux grandes catégories. En fonction des concentrations relatives en anticorps et en antigène, on distingue : *les techniques dites « par compétition »; *les techniques dites « en sandwich » (ou par extraction-saturation). : 

Méthodologie: des immunodosages peuvent être classés en deux grandes catégories. En fonction des concentrations relatives en anticorps et en antigène, on distingue : *les techniques dites « par compétition »; *les techniques dites « en sandwich » (ou par extraction-saturation).

les techniques par défaut d’Ac dites « par compétition »: Principe: Il s'agit de techniques  dans lesquelles des Ag marquées et non marquées (en excès) d'une même espèce entrent en compétition vis-à-vis d'un nombre limité de site de liaison d’ Ac. Une fois l'équilibre atteint, le pourcentage de marqueur lié est inversement proportionnel à la concentration de substance non marquée que l'on veut doser et qui a été ajoutée au milieu réactionnel. : 

les techniques par défaut d’Ac dites « par compétition »: Principe: Il s'agit de techniques  dans lesquelles des Ag marquées et non marquées (en excès) d'une même espèce entrent en compétition vis-à-vis d'un nombre limité de site de liaison d’ Ac. Une fois l'équilibre atteint, le pourcentage de marqueur lié est inversement proportionnel à la concentration de substance non marquée que l'on veut doser et qui a été ajoutée au milieu réactionnel.

on comprend qu'une augmentation de la concentration en antigène à dosé se traduise par une augmentation de la formation du complexe Ag-Ac à dosé au dépond du complexe Ag*-Ac marqué. Il en résulte une diminution du signal lorsque la concentration en Ag augmente. Ainsi la courbe d’étalonnage prend cette forme: le signale est inversement proportionnel à la concentration de l’Ag àdosé. : 

on comprend qu'une augmentation de la concentration en antigène à dosé se traduise par une augmentation de la formation du complexe Ag-Ac à dosé au dépond du complexe Ag*-Ac marqué. Il en résulte une diminution du signal lorsque la concentration en Ag augmente. Ainsi la courbe d’étalonnage prend cette forme: le signale est inversement proportionnel à la concentration de l’Ag àdosé.

Méthode de séparation: des complexes Ag-Ac/ Ag libre 1-piéger les Ag libre par le charbon activé → mesure de la quantité du traceur dans le surnageant. 2-précipité les complexe Ag-Ac (éthanol, acide TCA,Sulfate d’ammonium …) → mesure de la quantité du traceur dans le précipité.Conditions de travail: excès d’Ag marqué. Ac en quantité fixe et défini. Ag et Ac sont univalents. Ag à dosé et Ag marqué → même immunoréactivité et propriétés Phy-Chi. : 

Méthode de séparation: des complexes Ag-Ac/ Ag libre 1-piéger les Ag libre par le charbon activé → mesure de la quantité du traceur dans le surnageant. 2-précipité les complexe Ag-Ac (éthanol, acide TCA,Sulfate d’ammonium …) → mesure de la quantité du traceur dans le précipité.Conditions de travail: excès d’Ag marqué. Ac en quantité fixe et défini. Ag et Ac sont univalents. Ag à dosé et Ag marqué → même immunoréactivité et propriétés Phy-Chi.

Téchnique: *L’anticorps est immobilisé. *Une quantité limitée d’anticorps est utilisée; cettequantité est insuffisante pour lier toutes lesmolécules d’antigène dans l’échantillon. *L’échantillon, contenant une quantité inconnue del’antigène, est mélangé avec une quantité fixe etconnue de l’antigène marqué.* L’antigène dans l’échantillon et l’antigène marquésont en compétition pour un nombre limité desites anticorps. *La concentration de l’antigène dans l’échantillonpeut être déterminée à partir de la proportion del’antigène marqué qui est lié à l’anticorps ou de laproportion qui demeure libre en solution. *Pour des résultats quantitatifs, il est essentiel degarder le rapport d’anticorps (réactif limitant) àantigène marqué constant. : 

Téchnique: *L’anticorps est immobilisé. *Une quantité limitée d’anticorps est utilisée; cettequantité est insuffisante pour lier toutes lesmolécules d’antigène dans l’échantillon. *L’échantillon, contenant une quantité inconnue del’antigène, est mélangé avec une quantité fixe etconnue de l’antigène marqué.* L’antigène dans l’échantillon et l’antigène marquésont en compétition pour un nombre limité desites anticorps. *La concentration de l’antigène dans l’échantillonpeut être déterminée à partir de la proportion del’antigène marqué qui est lié à l’anticorps ou de laproportion qui demeure libre en solution. *Pour des résultats quantitatifs, il est essentiel degarder le rapport d’anticorps (réactif limitant) àantigène marqué constant.

Avantages: dosage des Ag de faible poids moléculaire (H. stéroïdes , médicaments)Inconvénients: marquage de l’Ag difficile. la plage de mesure restreinte. précision au deux extrémités de la courbe est mauvaise. faible signaux émis par le traceur. Importance de la précision au pipetage car la quantité de l’Ac est critique. la réalisation du blanc est parfois difficile. : 

Avantages: dosage des Ag de faible poids moléculaire (H. stéroïdes , médicaments)Inconvénients: marquage de l’Ag difficile. la plage de mesure restreinte. précision au deux extrémités de la courbe est mauvaise. faible signaux émis par le traceur. Importance de la précision au pipetage car la quantité de l’Ac est critique. la réalisation du blanc est parfois difficile.

les techniques par excés d’Ac dites « en sandwich »: Principe: L'analyte présent dans le spécimen à doser se lie aux sites anticorps de capture en excés fixés sur le support solide( tube, billes de verre, de polymères, particules magnétiques ou diverses) . L'anticorps de révélation marqué et en excès ajouté au milieu réactionnel, se lie alors à l'antigène déjà fixé sur le premier anticorps. L'analyte se trouve ainsi littéralement pris en « sandwich » entre les deux anticorps. Il suffit enfin d'éliminer l'excès d'anticorps marqué et mesuré le signale qui augmente avec la concentration de l’Ag. : 

les techniques par excés d’Ac dites « en sandwich »: Principe: L'analyte présent dans le spécimen à doser se lie aux sites anticorps de capture en excés fixés sur le support solide( tube, billes de verre, de polymères, particules magnétiques ou diverses) . L'anticorps de révélation marqué et en excès ajouté au milieu réactionnel, se lie alors à l'antigène déjà fixé sur le premier anticorps. L'analyte se trouve ainsi littéralement pris en « sandwich » entre les deux anticorps. Il suffit enfin d'éliminer l'excès d'anticorps marqué et mesuré le signale qui augmente avec la concentration de l’Ag.

ainsi la courbe d’étalonnage aura l’allure suivante:le signale est proportionnel a la concentration de l’Ag à dosé. : 

ainsi la courbe d’étalonnage aura l’allure suivante:le signale est proportionnel a la concentration de l’Ag à dosé.

Conditions de travail: Les Ac de captures et de révélations en excès. au moins deux déterminants antigéniques sur l’Ag à dosé. l’utilisation d’Ac de forte affinité conduisant à l’irréversibilité de la réaction. : 

Conditions de travail: Les Ac de captures et de révélations en excès. au moins deux déterminants antigéniques sur l’Ag à dosé. l’utilisation d’Ac de forte affinité conduisant à l’irréversibilité de la réaction.

Technique: L’échantillon d’antigène est incubé avec un excès d’anticorps de capture ; toutes les molécules d’antigène se lient à l’anticorps de capture immobilisé sur substrat solide, mais tous les sites anticorps ne sont pas occupés. Pour détecter la quantité d’antigène lié à l’anticorps immobilisé, un 2e anticorps marqué de révélation est ajouté qui se lie à un autre épitope de l’antigène - formation d’un « complexe sandwich » entre l’anticorps primaire, l’antigène et l’anticorps secondaire marqué : 

Technique: L’échantillon d’antigène est incubé avec un excès d’anticorps de capture ; toutes les molécules d’antigène se lient à l’anticorps de capture immobilisé sur substrat solide, mais tous les sites anticorps ne sont pas occupés. Pour détecter la quantité d’antigène lié à l’anticorps immobilisé, un 2e anticorps marqué de révélation est ajouté qui se lie à un autre épitope de l’antigène - formation d’un « complexe sandwich » entre l’anticorps primaire, l’antigène et l’anticorps secondaire marqué

Avantages: la sensibilité est accrue par la présence d’Ac en excès. la précision au pipetage est moins importante. La vitesse de la réaction est accélérée par l’excès d’Ac. La zone de travail est plus grande. La réalisation du blanc est facile.Inconvénients: effet crochet pour les concentration élevée. Interférence des anticorps hétérophiles : 

Avantages: la sensibilité est accrue par la présence d’Ac en excès. la précision au pipetage est moins importante. La vitesse de la réaction est accélérée par l’excès d’Ac. La zone de travail est plus grande. La réalisation du blanc est facile.Inconvénients: effet crochet pour les concentration élevée. Interférence des anticorps hétérophiles

Amplification et détection du signal: Anticorps primaires: le signal est porté par l’anticorps de la réaction Ag-Ac. Formation d’un complexe binaire Ag-Ac primaire le systéme binaire permet la liaison de 4 Ac primaire . : 

Amplification et détection du signal: Anticorps primaires: le signal est porté par l’anticorps de la réaction Ag-Ac. Formation d’un complexe binaire Ag-Ac primaire le systéme binaire permet la liaison de 4 Ac primaire .

Anticorps secondaires:le signal est porté par un anticorps dirigé contre l’anticorps primaire .Il se fixe sur sa partie constante (Fc).Formation d’un complexe ternaire.L’anticorps secondaire peut etre remplacer par une proteine A.le système ternaire peut fixé 4 Ac primaire et sur chaque Ac primaire 5 Ac secondaire donc on a la fixation indirectde 20 molécule de traceurs par molécule d’Ag. : 

Anticorps secondaires:le signal est porté par un anticorps dirigé contre l’anticorps primaire .Il se fixe sur sa partie constante (Fc).Formation d’un complexe ternaire.L’anticorps secondaire peut etre remplacer par une proteine A.le système ternaire peut fixé 4 Ac primaire et sur chaque Ac primaire 5 Ac secondaire donc on a la fixation indirectde 20 molécule de traceurs par molécule d’Ag.

Systèmes avidine/biotine: On peut conjugué les anticorps secondaire avec un molécule d’Avidine et chaque molécule d’ avidine peut se conjuguer avec 4 molécule de biotine portant chacune le signal a mesuré. Se qui permet une amplification encore plus grande. : 

Systèmes avidine/biotine: On peut conjugué les anticorps secondaire avec un molécule d’Avidine et chaque molécule d’ avidine peut se conjuguer avec 4 molécule de biotine portant chacune le signal a mesuré. Se qui permet une amplification encore plus grande.

Problémes des méthodes immunochimiquesEffet crochet: : 

Problémes des méthodes immunochimiquesEffet crochet:

Anticorps hétérophiles: La présence d'anticorps dirigés contre les immunoglobulines de l'espèce qui a servi à la préparation des anticorps monoclonaux est susceptible d'interférer dans le dosage. Ces anticorps apparaissent dans diverses circonstances : sujets en contact avec des animaux, maladies auto-immunes (facteurs rhumatoïdes), administration d'anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou thérapeutiques. : 

Anticorps hétérophiles: La présence d'anticorps dirigés contre les immunoglobulines de l'espèce qui a servi à la préparation des anticorps monoclonaux est susceptible d'interférer dans le dosage. Ces anticorps apparaissent dans diverses circonstances : sujets en contact avec des animaux, maladies auto-immunes (facteurs rhumatoïdes), administration d'anticorps monoclonaux à des fins diagnostiques ou thérapeutiques.

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