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DNA É O MATERIAL GENÉTICO: TOPOLOGIA DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS

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A informação guardada nos genes é transmitida milhões de vezes em forma inalterada durante a vida de um organismo multicelular ! Que tipo de molécula seria capaz de sustentar tal numero de exatas replicações e dirigir o desenvolvimento de um organismo  Que tipo de instruções carrega a informação genética Como a imensa quantidade de instruções são fisicamente organizadas de tal forma que possam ser contidas dentro de uma célula Algumas respostas começaram a emergir nos 40s, estudos com fungos onde se viu que informação consistia de instruções para fazer proteínas e que estas ultimas eram as responsáveis pelas propriedades e funções da célula. A informação pode passar de duas formas para a geração seguinte, para ovo fertilizado (na reprodução sexual) ou para a célula filha (na reprodução asexual). Um particular fato na estrutura do DNA é que esta é independente da seqüência de nt. Relação entre a seqüência de DNA e a seqüência correspondente da proteína: código genético

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Histórico Descobrimento do DNA

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1865 – Johann Gregor Mendel Publicou resultados dos cruzamentos de ervilhas Pisum sativum. Noticiou o aparecimento e desaparecimento de características em vagens e flores em várias gerações. Postulou as regras que governam a hereditariedade. Propôs a existência de discretas unidades de hereditariedade (genes), que seriam transmitidas de geração para geração. Histórico ( cont.) 1869 – Johann Friedrich Miescher Realizou o primeiro isolamento de DNA.

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Histórico ( cont.) 1928- Griffith Primeira evidencia que o material genético estava constituído por ácidos nucléicos expt. de transformação realizados por com Streptococus Pneumococus “principio de transformação”.

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1944- Avery e cols. “Baseado nas propriedades físico-químicas a substância indutora parece ser uma forma de DNA altamente polimerizada e viscosa”. Polissacarídeo capsular do tipo III, cuja síntese é promovida pelo “principio transformante” consiste de um polissacarídeo não nitrogenado (material genético vs. produtos de expressão)

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1947-Erwin Chargaff 1952- Hershey e Chase Se nos estamos certos, e ele estava, “Os ácidos nucléicos não são estruturalmente importantes, mas sim uma substância funcionalmente ativa na determinação das atividades bioquímicas e características específicas da célula, e o conhecimento desta substância permitirá induzir mudanças previsíveis e herdáveis na célula “.

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1952 Rosalind Franklin Difração de raios X, mostrou um padrão de periodicidade e largura uniforme do DNA 1953 – Watson e Crick -Difração de raios X mostrou que o DNA possui uma forma de hélice regular, fazendo uma volta completa cada 34 Å, com um diâmetro de aprox. 20 Å e desde que a distância entre dois nucleotídeos adjacentes é de 3.4 Å a cada volta deve de existir 10 nt. - A densidade do DNA indica que a dupla hélice contem duas cadeias polipeptídicas e o diâmetro constante da hélice pode ser mantido se o pareamento é realizado sempre entre uma purina e uma pirimidina. - A proporção de G e sempre igual a de C e a de A a de T. por tal motivo a composição de qualquer DNA pode ser dada pela % de G+C a que varia entre 26-74 % entre diferentes espécies.

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1953 – Watson e Crick Propuseram a estrutura do DNA como dupla hélice. A estrutura proposta a partir de estudos de cristalografia de raios-X realizados por Franklin. Ganharam o prêmio Nobel de fisiologia em 1962.

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Os componentes do DNA

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DNA vs. RNA Pentoses Ácidos nucléicos Polímeros lineares de nucleotídeos unidos por ligações fosfodiester

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Bases nitrogenadas Citosina O N N H H H N H O O N H3C H Timina Purinas Pirimidinas Adenina N H N H N H N N H H H N H O O N H H Uracila

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Nucleotídeos

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Os nucleotídeos podem agir como transportadores de energia de curta vida, o principal e o ATP

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Base nitrogenada Adenina

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Base nitrogenada Guanina 1’

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Base nitrogenada Timina 1’

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Base nitrogenada Citosina 1’

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A = T G  C Bases são complementares. Pontes de hidrogênio são formadas entre as bases: A = T  2 pontes de hidrogênio G  C  3 pontes de hidrogênio G  C É MAIS ESTÁVEL Pareamento de Bases

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Pareamento de nucleotídeos Pontes de hidrogênio CH2 O OH Guanina O N N N H N N H H H O H2C OH Citosina

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Pareamento de nucleotídeos Pontes de hidrogênio

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Polimerização OH O H2C

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Pareamento de fitas de DNA Invertido e Complementar

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Volta completa cada 34 Å, com um diâmetro de aprox. 20 Å e desde que a distância entre dois nucleotídeos adjacentes é de 3.4 Å a cada volta deve de existir 10 nt. A proporção de G e sempre igual a de C e a de A a de T. A especificidade no pareamento das bases é crucial, o movimento dos átomos de hidrogênio permitem que cada base exista de forma tautomerica, onde os grupos amino (NH2) e cetos (C=O) estão opostos aos grupos iminos (NH) e henol (COH) -

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* Este modelo requer que as cadeias corram em direções opostas “antiparalelas”, onde os açúcares e grupos fosfatos encontram-se voltados para fora conferindo carga negativa ao DNA.

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O DNA se replica em forma semiconservativa Principal requerimento: a informação se deve reproduzir exatamente 1958 - Meselsom-Stahl “Reprodução é semiconservativa”

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Os pares de bases estão perpendiculares à coluna açúcar-fosfato e contribuem à estabilidade termodinâmica da dupla hélice de duas formas: a- pela união de pontes de hidrogênio ( interações “ Watson-Crick” ou “canônicas” ) b- pelo pareamento hidrofóbico das bases ( interações “stacking” ou “ empilhamento”). Interações eletrostáticas: fosfatos que desestabilizam interações inter-intracadeias e que são neutralizadas pelos íons Na+

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Estabilização da Molécula de DNA O que estabiliza a estrutura em hélice?   ligações covalentes em cada fita ligações de hidrogênio entre as bases - interações hidrofóbicas entre as bases Forças de Van der Walls devido ao empilhamento das bases - Interação de cátions com o esqueleto açúcar fosfato

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Interações Hidrofóbicas Associação de grupos não-polares, de forma a “fugir” da água. Exemplos: Óleo em contato com a água Micelas MC – elástica e resistente graças a interações hidrofóbicas entre grupos apolares dos fosfolipídeos Estrutura de proteínas

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Os anéis cíclicos e heterocíclicos das bases nitrogenadas possuem uma natureza apolar, ou seja, são hidrofóbicos. Por isso as bases nitrogenadas são voltadas para o interior do polímero, região pobre em moléculas de água, de forma a minimizar o contato com esta. Interações hidrofóbicas como forma de estabilização da estrutura do DNA

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A natureza apolar dos anéis das bases também leva à ocorrência de interações hidrofóbicas entre elas, de forma que se aproximam (se empilham) e compartilham elétrons pi, resultando em uma conformação favorável Esse empilhamento leva ao estabelecimento de forças atrativas de Van Der Walls entre os anéis de bases adjacentes, que embora fracas, também contribuem para a manutenção da estrutura. Interações hidrofóbias por Empilhamento ( stacking)

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“Empilhamento” (base stacking) : duas bases planas sobrepostas interação de nuvens de elétrons pi dos anéis aromáticos das bases forças de Van der Walls estabilização da estrutura

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(b) Cada base é mostrada como um bloco e o esqueleto açúcar fosfato é mostrado como linhas sólidas (forma não empilhada) (c) Mostra como funciona a interação hidrofóbica e o empilhamento das bases, e sua torção em 30º. Essa torção é a responsável pela forma helicoidal do DNA Estrutura Helicoidal (d) Brometo de etídio (barras laranjas) intercalado entre as bases resulta numa molécula esticada

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Possui uma estrutura hidrofóbica que se insere entre as bases através de interações hidrofóbicas Isso tem o efeito de ‘desempilhar’ as bases e esticar a molécula de DNA Brometo de Etidio

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Energia de empilhamento das bases por vários pares de bases adjacentes

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O DNA dupla hélice tem estruturas alternativas As diferentes estruturas da dupla hélice é determinada pelos seguintes parâmetros: N = número de nt. por volta. H = distância entre unidades repetidas. A variação nestes parâmetros leva a mudanças no grau de rotação. Assim na forma B, cada par de base gira 36 graus em volta do eixo, portanto cada 10bp acontece um giro completo, com uma região estreita de 12 Å “sulco menor” e uma ampla de 22 Å “sulco maior” e a torção das duas fitas entre si formam uma dupla hélice. híbridos RNA-DNA açúcar e a base do mesmo lado da ligação glicosidica

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Topologia dos ácidos nucléicos Supercoiling: DNA dupla fita está enrolado no espaço ao redor de seu próprio eixo. Apenas em estruturas fechadas. Superenrolamento negativo: gerado por desenrolamento da dupla hélice (presente na natureza). superenrolamento positivo: gerado por enrolamento na mesma direção da dupla hélice ex. arquibactérias. Plectonêmico: dado em solução Toraidal: quando o DNA esta enrolado em proteínas como histomas ( positivo ou negativo)

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O superenrolamento pode ser descrito matematicamente LK = Tw + Wr - LK, número de vezes que uma das fitas passa sobre a outra. - Tw, numero de voltas de hélices - Wr, grau de superenrolamento. Wr e Tw podem variar linearmente. Moléculas com = LK podem ter  Wr e Tr e pelo tanto diferentes conformações tridimensionais (topologia).

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Moléculas com tamanhos e seqüências idênticas, mas  na sua topologia se chamam de topoisomeros

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Uma simples cadeia pode ter uma estrutura secundaria Primeiro passo para determinar a possível estrutura é dado pela determinação da energia livre (quantidade de energia liberada por uma reação) Fatores que determinam a presença de curvatura no DNA - Resíduos de adenina intercaladas - Ligação a proteínas ex. Nucleossomas 145 pb se enrolam 2 vezes no octámero de histomas. Fator de transcrição CAP Repressor de operon lac G= Gi + Gx + Gu. Gi: energia livre de iniciação de uma dupla hélice,valor positivo 3,4 Kcal/mol, energia requerida para formar o primeiro par de bases (duplex intermolecular e não intramolecular). Gx: somatória de reações individuais envolvidas na propagação da dupla hélice, ou somatória das energias liberadas quando cada par é acrescentado pelo tanto é negativo. Gu: somatória de instâncias nas quais as bases não são complementarias a energia requerida para manter estas bases não pareadas pelo que é positiva. “O valor total da energia livre da reação deve ser (-) para formar uma dupla hélice” G-C: G = -2.4 Kcal/mol > A-T: G =-1,3 Kcal/mol. Maior % G-C maior estabilidade. G de cada reação depende da composição e seqüência de bases Ex GG/CC e GC/CG (-5Kcal/mol) CG/GC (-3,2 Kcal/mol).

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Possíveis estruturas a partir de regiões duplas de RNA formadas por uma sRNA não totalmente complementar. Todas estas estruturas possuem um G positivo, que são incluídos no termo Gu.

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Outras estruturas Estruturas cruciformes: (G =50 Kcal/mol vs. G = 18 Kcal/mol. ) H-DNA: DNA contendo repetições de pirimidinas e purinas (TC)n (seqüências regulatórias). Bolhas de DNA fita simples: regiões com tendência a adquirir conf. fita simples que são estáveis quando presentes em moléculas circulares superenroladas ex.ori C 13pb. R-Loops: RNA de seq. complementar se párea em uma fita de dupla hélice ( transcrição). D-loops: fitas adicionais de DNA se ligam a dupla hélice, favorecido em DNA superenrolados negativamente RecA de E.coli também no DNA nitrocondrial. Estruturas Holliday: envolve as 4 fitas de DNA intermediários no processo de recombinação Nós e estruturas encadeadas: ligações intramoleculares e intermoleculares; recombinação e replicação DNA circulares

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Topoisomerases: Isomerizam uma forma topológica do DNA em outra. Quebra transitória na ponte fosfodiester. e permite que as fitas de DNA passem uma sobre as outras, alterando, o superenrolamento da molécula. Topoisomerase I e III: - Quebram apenas uma fita - Permanecem covalentemente ligadas ao grupo fosfato 5’ ( fosfo-tirosina); - Retiram superenrolamentos negativos e positivos (I) e apenas negativos (III) - Alteram LK em uma unidade. - Não necessita de ATP ou NAD para a ligação, utiliza energia armazenada na clivagem.

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Topoisomerase II: ( DNA girase): introduz super-enrolamentos negativos, LK em 2 unidades ( replicação, transcrição, reparo e recombinação) Induz superenrolamento negativo em DNA circular até x1,5 do encontrado no DNA nativo - Relaxa DNA superenrolado negativamente na ausência de ATP; - Promove a quebra das duas fitas do DNA; - Hidrolisa ATP na presença de DNA dupla-hélice; - Envolve DNA ao seu redor; - Produz e desfaz encadeamentos e nós.

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O mecanismo de ação da DNA-girase Ligação ao DNA, sgto de DNA de 105 a 140 pb, 20 pb ricos em A e regiões adjacentes, ricas em GC Clivagem das duas fitas do DNA na região central da ligação ao DNA diferença de 4 pb. ( ligação covalente 5’ de cada fita clivada com a tirosina 122 das subunidades A da girase). Uma região de DNA próxima do fragmento ligado à enzima é passada através do ponto de clivagem que é facilitado pela ligação de ATP na subunidade B. 4. As fitas são religadas, utilizando a energia armazenada

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Outras funções 1. Participa, nos processos de repartição de plasmídeos e cromossomos nas células filhas. 2. Processo de recombinação não-homóloga. As funções na transcrição 1. Durante o alongamento da transcrição, desfazendo o superenrolamento positivo causado pelo deslocamento da bolha de transcrição. As funções na replicação “in vitro” 1. Manter o molde superenrolado negativamente para a montagem do complexo de iniciação e desnaturação do dúplex na origem; 2. Promover o superenrolamento negativo para contrapor ao superenrolamento positivo, causado pela abertura das fitas e deslocamento da enzima DNA polimerase; 3. Desfazer o encadeamento das moléculas nos estágios finais da replicação. * A DNA-girase atua no controle da homeostasia para manter o superenrolamento dentro de limites fisiológicos no cromossomo.

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As topoisomerases em eucariotas 1. As topo I e II envolvidas na replicação, transcrição, recombinação e montagem da cromatina, condensação e formação dos cromossomos. 2. A topo I ( 90- 130 KDa) relaxa superenrolamentos negativos e positivos igual eficiência preferência por DNA dupla fita. 3. As topo II ( 150-180 KDa) isoladas de leveduras, Drosofila, xenopus e células humanas, semelhantes relaxam superenrolamentos negativos e positivos em ATP Em lev. genes Topo 1, 2 e 3 - Deleção em Topo 1: não altera replicação, crescimento ou div. Celular - “ “ “ 2: essencial mitoses, sínteses de DNA e separação dos cromossomos - Topo I e II agem em conjunto removendo os dominios de superenrolamento formados pelo mov. da bolha de transcrição. 4. Eucariotos apresentam topo mitocondrial e cloroplástica ( similar a procariotos), em tripanosomatideos ( ~ topo II )

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O DNA pode ser desnaturado e renaturaado O processo de separação das fitas de DNA (desnaturação) acontece sob condições fisiológicas onde a especificidade do processo é dada pela complementaridade das bases. Aumento de temperatura, Titulação com Ácidos (protonizam os aneis nitrogenados A,C e G) “ “ Alcalis (deprotonizam os anéis de G e T) Agentes denaturantes ex. formamida e DMSO. Geram grupos carregados no interior da dupla hélice, mudanças nas propriedades físico- químicas ex. densidade Efeito hipocrômico: diminuição da A260nm ,interação entre as bases (DNA dupla hélice). A260nm (dsDNA)< A260nm (nt livres) Efeito hipercrômico: aumento da A260nm ,desnaturação da dupla hélice. A260nm (dsDNA) ~ A260nm (nt livres)

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Temperatura de derretimento (Tm ): temperatura na qual os 50% do DNA se encontra desnaturado se chama de Tm * Tm depende da composição das bases G-C incrementando 0.4º por 1% incremento de G-C Ex. DNA com um 40% de G-C Tm=87 ºC Incremento de 16,6 ºC por cada 10 x na conc. de cátion monovalente. sob condições fisiológicas a dupla hélice é muito estável pelo que a desnaturação requer a participação de enzimas específicas helicases e proteínas estabilizadoras as SSBs. * Em presença de agentes como formamida Tm se reduz para 40º ( desestabiliza as pontes H) Tm (Cº) = 69,3 + 0.41(GC%).

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Hibridização hibridização líqüida; em filtros, A desnaturação é reversível sob condições apropriadas, renaturação, dois passos: Se encontram regiões complementares; Pareamento se estende a toda a região “zipper”, restaurando-se as propriedades perdidas

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Mutações pontuais mudam um simples par de bases As mutações proporcionaram decisivas evidencias que o DNA é o material genético. Duas possíveis origens: mal função do sistema de reparo ação de produtos químicos sobre o DNA

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Todas as bases são igualmente susceptíveis? A probabilidade estatística que uma mutação aconteça num dado local se denomina de “cinética de impacto aleatório”

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Compactação do DNA Correlação entre complexidade de um organismo e o numero de genes ex. bactérias < de 500 genes, no genoma humano aprox. 30,000 genes. Falta de correlação entre complexidade e tamanho do genoma ex genoma humano 200x > Lev.; 300x < que plantas e 200x < que ameba

DNA-A molécula da vida : 

DNA-A molécula da vida O corpo humano é formado por trilhões de células. Cada célula contém: 46 cromossomos. 2 metros de DNA. 3 bilhões de pares de base (pb). Informação contida no genoma é gigantesca! Aproxim. 30.000-40.000 genes codificam mais de 100.000 proteínas.

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Complexo DNA- proteínas histônicas e não histônicas se chama “cromatina”. Proteínas histônicas: organização básica da cromatina ( H1, 2A, 2B, 3 e 4) Proteínas não histônicas: menor número; organização superior da cromatina ex. fatores de transcrição. Organização do genoma humano “ 2 metros de DNA num núcleo 6m de diâmetro, empacotar 40 km de um fio numa bola de tênis ”. “genoma humano com 3.2x109 nt em 22 pares de cromossomos”.

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Compactação do genoma bacteriano

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Principais funções do cromossomo: replicação, separação e partição do DNA replicado nas células filhas (um centrômero, 2 telômeros e origens de replicação).

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Nucleossomos Unidades fundamentais de organização. Complexo de histonas ligadas ao DNA ( 60x106 cópias) Interação entre DNA e histonas: 142 pontes hidrogênio e numerosas interações hidrofóbicas cores de histonas ricos em lisina e arginina, aa básicos virtualmente qualquer segmento de DNA pode se ligar a uma histona.

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Histonas: ( 102-135 aa) motivo estrutural 3  helices conectadas por 2 loops

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No nucleosomo o posicionamento do DNA é determinado pela flexibilidade do DNA e por outras proteínas. Os nucleosomos são empilhados numa fibra compacta de cromatina de 30 nm o que gera uma estrutura altamente condensada

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Fibras de 30 nm: alta organização dos nucleossomos 2 mecanismos: Histona H1 Caldas das histonas ( empacotamento de nucleossomos)

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Nucleossomos

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ATP dirige a maquinaria que leva ao remodelamento da cromatina mudando a estrutura do nucleossomo. Importantes conseqüências: Acesso de proteínas engajadas nos processos de replicação, transcrição e regulação da expressão gênica A modificação covalente das caudas das histonas podem afetar profundamente a cromatina. Modificações covalentes dos extremos aminos das histonas: acetilação, metilação de lisinas e fosforilação de serinas

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3’ mRNA 5’ Principais tipos de RNA Aminoácido 5´ 3´ tRNA Anticódon

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