Slide 1:Replicarea ADN «There must be two if life shall succeed…» -cantec popular danez-


CE ESTE REPLICAREA ADN? :CE ESTE REPLICAREA ADN? Biosinteza ADN Are loc astfel încît să fie asigurată stabilitatea genetică în organism şi în cadrul speciei (este o modalitate specifică de biosinteză care permite conservarea şi transmiterea informaţiei genetice de la o generaţie la alta).


Cînd şi unde are loc replicarea ADN? :Cînd şi unde are loc replicarea ADN? Faza S a ciclului celular Nucleu La eucariote replicare are loc doar în faza S, de sinteză, a ciclului celular, faza separată de faza mitotică M prin perioadele de gol (gap) sintetic G1 şi G2.


REPLICAREA ADN PE SCURT :REPLICAREA ADN PE SCURT Dublul helix al ADN se desface şi se construiesc pe fiecare dintre cele două catene parentale (numite catene matriţă sau template) cîte o catenă complementară replica celor parentale.


Slide 5:Replicarea – cu ceva mai multe detalii 1. Dublul helix se desface. 2. La joncţiunea dintre cele două catene parentale desfăcute ia naştere bifurcaţia de replicare. 3. O nouă catenă se formează prin Împerecherea nucleotidelor libere cu bazele complementare de pe catena veche. 4. Rezultă două molecule-fiice de ADN care conţin cîte o catenă Parentală şi o catenă nouă.


Slide 6:semi-conservativă completă bi-direcţională (deşi are loc întotdeauna în direcţia 5’ 3’ !!!) semi-discontinuă CARACTERISTICILE REPLICARII ADN


1. Replicarea ADN este semi-conservativă (Meselson-Stahl, 1958). :1. Replicarea ADN este semi-conservativă (Meselson-Stahl, 1958). Fiecare moleculă fiică de ADN conţine o catenă parentală intactă asociată cu o catenă nou sintetizată.


Slide 8:Meselson & Stahl’s Famous Experiment (1958)


2. Replication este completă :2. Replication este completă Replicarea ADN antrenează întregul cromozom, rezultand doi cromozomi identici. Cromozom circular (procariote)


3. Replicarea ADN este bi-direcţională (Cairns, 1963). :3. Replicarea ADN este bi-direcţională (Cairns, 1963). Replicarea începe într-un punct bine determinat numit origine de replicare (ori) şi pornind din acest punct se derulează simultan în ambele direcţii. bidirecţional


4. Replicarea este semi-discontinuă :4. Replicarea este semi-discontinuă Reiji Okazaki a propus şi demonstrat în 1968 că în timp ce sinteza unei catene (catena leading) este continuă, sinteza celei de-a doua catene (catena lagging ) este discontinuă (în runde de 150-250 nt).


Întrebare: :Întrebare: Următoarele afirmaţii în ceea ce priveşte replicarea ADN sunt corecte: Replicarea se realizează pe anumite porţiuni din cromozom. Sinteza ADN pe catena lagging este continuă. Fiecare moleuclă fiică de ADN conţine două catene nou sintetizate. Fiecare catenă a ADNdc acţionează ca matriţă/template pentru o nouă catenă de ADN.


Elementele esenţiale necesare replicării :Elementele esenţiale necesare replicării Sunt necesare cinci elemente esnţiale : ADN parental- matriţa (fiecare catenă de ADN serveşte ca matriţă) cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfaţi dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) cele 4 ribonucleozid trifosfaţi NTP (ATP, GTP, UTP, CTP); aceasta sugerează necesitatea sintezei de ARN în cursul sintezei de ADN!!! Proteine specifice, majoritatea enzime Mg2+


Proteine specifice implicate în replicare :Proteine specifice implicate în replicare


Enzimele implicate în replicarea ADN :Enzimele implicate în replicarea ADN


Slide 16:Proteine implicare în replicarea ADN la E. coli (aproximativ 30 proteine)


Helicaza desface dublul helix :Helicaza desface dublul helix Proteina DnaB Hexamer Catalizează un fel de denaturare in vivo a ADN (catenele dezrăsucite pot fi citite de către enzimele replicării) necesită energie; consumă 2 molecule de ATP per 2 legături de hidrogen desfăcute.


Single stranded proteins (SSBs) :Single stranded proteins (SSBs) Tetramer Se leagă de cele două catene ADN şi le menţine separate prevenind renaturarea lor Prezintă o cavitate de 15Å încărcată pozitiv Trebuie să fie îndepartate înainte ca noua catenă de ADN să poată fi sintetizată


Topoisomerazele :Topoisomerazele enzime care rezolvă tensiunile sterice (torsiuni +, de dreapta) apărute în cursul dezrăsucirii (cu o viteză de 100 revoluţii/sec !!!) duplexului ADN, şi care ar putea bloca replicarea


Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I :Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I acţionează ca o endonuclează reversibilă, printr-un mecanism de tăiere-coasere care permite rotaţia liberă a ADNmc (acţiune de suveică) . “economică” (nu necesită aport energetic): hidrolizează o legătură fosfat diesterică a cărei energie o conservă într-o legătură fosfat esterică implicînd Tyr din centrul activ al enzimei şi ulterior o foloseşte la refacerea catenei incizate tăiere relaxare coasere


Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II :Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II ADN-giraza Dimer Introduce în molecula de ADN supertorsiuni (-), spre stînga, în sens contrar celor create de înaintarea bifurcaţiei de replicare; astfel compesează în avans constrîngerile impuse de desrăsucirea duplexului de ADN Necesită energie (consum de ATP) Acidul nalidixic, Norfloxacinul (Ab cu toxicitate redusă, care nu dezvoltă rezistenţă plasmidică transferabilă)- inhibă activitatea ADN-girazei


ADN polimerazele-ADN dependente: :ADN polimerazele-ADN dependente: Copiază catena matriţă în direcţia 3’ 5’ Sintetizează catena nouă în direcţia 5’ 3’: formează legături fosfat diesterice între două dNTP vecine dictate de template, prin atacul nucleofil realizat de către gruparea 3’-OH al primului nucleotid asupra grupării α fosfat din dNTP următor) Necesită un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-ul sintetizat de primază serveşte drept primer) AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazică, care stă la baza capacităţii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele greşit împerecheiate de la capătul 3’ al catenei în creştere. PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menţine legată de matriţă; este o expresie a numărului de nucleotide adăugate la lanţul ADN în creştere înainte ca polimeraza să se disocieze de matirţă)


Slide 23:P P P P P P P P P P CH2 CH2 CH2 OH OH O O O Base Base Base CH2 CH2 CH2 OH O O O Base Base Base Cap 5' Cap 3‘ (în creştere) 3' 5' 3' H20 + REACTIA CATALIZATĂ DE ADN POLIMERAZĂ Piro- fosfat


Clase ADN polimeraze -ADN dependente: :Clase ADN polimeraze -ADN dependente: procariote: ADN pol I, II, III, IV, V eucariote: - ADN pol α, β, γ, ε, δ


Proprietăţile ADN polimerazelor la procariote :Proprietăţile ADN polimerazelor la procariote


Este ADN polimeraza I polimeraza replicativă principală? :Este ADN polimeraza I polimeraza replicativă principală?


DNA polimeraza I nu este polimeraza replicativă principală! :DNA polimeraza I nu este polimeraza replicativă principală! Enzima este prea lentă!ADN polimeraza I cataliează încorporarea dNTP cu o viteză maximă de 20 nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E. coli, care în realitate se divide la fiecare 20 min. Enzima nu este suficient de procesivă. Enzima este prea abundentă.Există aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celulă E. coli şi doar 2 bifurcaţii de replicare per celulă. Celulele prezentînd mutaţii polA1 sunt viabile.


DNA polimeraza III este polimeraza replicativă :DNA polimeraza III este polimeraza replicativă Proprietăţile ADN pol III sunt potrivite pentru o enzimă care deţine un rol central în replicarea ADN: are o procesivitate foarte mare şi catalizează polimerizarea la o viteză foarte înaltă (250-1000 nt/sec). Sinteza catenei leading.


Care este rolul ADN polimerazei I ? :Care este rolul ADN polimerazei I ? La ce foloseşte activitatea 5’-3’exonucleozică, specifică acestei polimeraze? La ce foloseşte activitatea polimerazică a ADN pol I ? Îndepărtarea primerului de la capătul 5’ al lanţului în creştere Sinteza catenei lagging, înlocuirea cu dNTP a locului lăsat liber de primer şi repararea leziunilor ADN (ex. leagă dNTP pe locul liber apărut după îndepărtarea baze greşit împerechiate)


ADN polimerazele la procariote (continuare) :ADN polimerazele la procariote (continuare) ADN pol II este implicată în reparea leziunilor ADN (are activitate 3' -> 5‘ exonucleazică. ADN pol IV - Pol IV este o ADN polimerază predispusă la erori de împerechere (nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II şi pol I) - Pol IV este responsibilă de 50% din mutaţiile adaptative. ADN pol V - Pol V aparţine unei căi speciale de reparare (un fel de “ultima barieră“) denumită calea SOS de reparare a ADN. - Pol V este sintetizată cînd celula este expusă la doze mari de radiaţii sau de mutageni, cînd pot să apară lez. majore ADN.


Proprietăţile ADN polimerazelor la eucariote :Proprietăţile ADN polimerazelor la eucariote


Slide 32:Primaza: Sintetizează oligoribonucleotidul (ARN primer) iniţial pe care se ataşează ADN polimeraza. ARN primer este format din 4-12 ribonucleotide. Noua catenă de ADN se constuieşte prin adăugarea de nucelotide la capătul 3 al ARN primer. - ARN primer e înlocuit în final cu ADN.


Întrebare: :Întrebare: ADN polimeraza: A. Initiază sinteza lanţului polinucleotidic B. Sintetizează un lanţ polinucleotidic în diercţia 3’- 5’ C. Citeşte matriţa de ADN în direcţia 5’- 3’ D. Produce cîte o moleculă de pirofosfat la adăugarea fiecărei nucleotide la catena în creştere.


Slide 34:ETAPELE REPLICĂRII ADN (şi elementele-cheie ale fiecărei etape) Iniţierea: primozomul- un complex de proteine şi originea replicării ori Elongarea: replizomul- un complex de proteine, asociate cu ADN cu rol în sinteza catenelor noi de ADN Terminarea: proteina Tus protein situsul de terminare ter


REPLICAREA ADN LA PROCARIOTE :REPLICAREA ADN LA PROCARIOTE


1. INIŢIEREAcontrolează întregul proces de replicare! :1. INIŢIEREAcontrolează întregul proces de replicare!


Iniţierea replicării :Iniţierea replicării Identificarea originii de replicare Dezrăsucirea mediată de către helicază (denaturarea) duplexului ADN cu fomarea ADNmc şi a bifurcaţiilor de replicare Legarea SSB la ADNmc Formarea primozomului (conţine şi primaza) Sinteza ARN primer


Originea replicării :Originea replicării Originea replicării (oriC) este o regiune de 245 perechi baze bogată în AT OriC este recunoscută de către proteina dnaA care se leagă la oriC, şi care împreună cu proteina dnaB (helicaza) desface ADNdc (folosind ATP).


Primozomul- elementul cheie al iniţierii- :Primozomul- elementul cheie al iniţierii- Primozomul este un complex de proteine care este format din: - dnaB (helicază) - dnaC (şaperon al dnaB: asistă plicaturarea dnaB) - primaza - alte proteine Primozomul se deplasează împreună cu bifurcaţuia de replicare, consumînd ATP Primozomul este responsabil pentru sinteza ARN primer.


2. ETAPA DE ELONGARE :2. ETAPA DE ELONGARE


Etapa de elongare :Etapa de elongare Sinteza de ADN prin adăugarea de dezoxiribonucleotide (una cîte una) iniţial la capătul 3’ al ARN primer, ulterior la capătul 3’ end al catenei în creştere.


Etapa de elongare :Etapa de elongare Catena parentală 3’- 5’ (care este citită în aceeşi direcţie cu deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiată continu. Catena nouă astfel sintetizată este catena “leading”.


Etapa de elongare :Etapa de elongare -Catena parentală 5’- 3’ (care este citită în direcţie opusă faţă de deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiată discontinu. Catena nouă astfel sintetizată este catena “lagging” şi este sintetizată în fragmente mici (1fragment per rundă sinteză)-fragmentele Okazaki


Etapa de elongare :Etapa de elongare Replicarea ADN la E. coli are viteza ~1000 nt/s Polimeraza III (subunitatea b) formează un inel care alunecă pe ADN matriţă şi care creşte procesivitatea miezului Pol III de la 10-15 la>5000 perechi bază 35Å diametru; (+) interior, (-) exterior


Slide 45:Replicarea bidirectionala a cromozomului circular la procariote produce un intermediar în forma literei Theta.


Replizomul- elementul cheie al elongarii- :Replizomul- elementul cheie al elongarii- complex de proteins care cuprinde toate enzimele şi factorii necesari replicării ADN. Probabil ataşat de membrana nucleară, iar ADN ar străbate replizomul. este responsibil pentru sinteza a două catene noi de ADN.


Schema etapelor de iniţiere şi elongare :Schema etapelor de iniţiere şi elongare Okazaki fragment


3. ETAPA DE TERMINARE :3. ETAPA DE TERMINARE


Terminarea replicării :Terminarea replicării Regiunea de terminare : - situată la 180 grade faţă de ori; conţine “capcane” petur bifurca’ia de replicare - la acest nivel bifurcaţiile de replicare se întîlnesc şi dezleagă catenele de ADN încă asociate. Situsurile de terminare sunt porţi care permit trecerea bifurcaţiei de replicare într-un singur sens; - conţin 23 perechi de baze TerD TerC TerB TerA


Slide 50:Situsurile Ter forţează cele două bifurcaţii de replicare să se întîlnească într-un punct specific.


Repetiţia este “mama” învăţăturii… :Repetiţia este “mama” învăţăturii…


Replicarea :Helicaza se leagă la originea de replicare şi dezrăsuceşte dublu helixul ADN. Replicarea


Replicarea :DNA pol adaugă nucleotide la ARN primer. Replicarea


Replicarea :DNA pol verifică bazele împerecheate şi le înlocuieşte pe cele greşit împerecheate. Replicarea


Replicarea :Sinteza catenei leading continuă în direcţia 5’ to 3’. Replicarea


Replicarea :Sinteza discontinuă produce segmente ADN numite fragmente Okazaki. Replicarea


Replicarea :5’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Direcţia de avansare a bifurcaţiei de replicare 3’ Alungirea fragmentului Okazaki. Okazaki fragment Replicarea


Replicarea :5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Alungirea catenei leading şi sinteza de noi fragmente pe Okazaki măsură de bifurcaţia mai avansează. Replicarea


Replicarea :3’ 5’ 3’ Alungirea noului fragment Okazaki, în paralel cu alungirea catenei leading . Replicarea


Replicarea :Activitatea exonucleazică a ADN pol I îndepărtează ARN primer. Replicarea


Replicarea :Activitatea polimerazică a ADN pol I umple golurile. Ligaza formează legături fosfatdiesterice între gruparea 3’ OH de la capătul unui fragment Okazaki cu gruparea 5’ fosfat de la capătul altui fragment Okazaki. . Replicarea


Slide 63:Topoisomerase nicks DNA to relieve tension from unwinding 2 3 1 4 5 6 7 Pol III synthesises leading strand Helicase opens helix Primase synthesises RNA primer Pol III elongates primer; produces Okazaki fragment Pol I excises RNA primer; fills gap DNA ligase links Okazaki fragments to form continuous strand REPLICAREA ADN


Întrebare: :Întrebare: Fragmentele Okazaky sunt: Produsul acţiunii helicazei Lanţuri ADN sintetizate în cadrul catenei leading în cursul replicării Regiuni ale ADN care nu codifică informaţie pentru sinteza de ADN. Fragmente relativ scurte de polidezoxiribonucleotide cu cîteva ribonucleotide la capătul 5’.


Slide 65:Replicarea simultană prin formarea de bucle ale matriţei catenei lagging.


Slide 66:Replicarea simultană: molecula ADN pol III este responsabilă de sinteza ambelor catene de ADN.


DNA REPLICATION IN EUKARYOTES :DNA REPLICATION IN EUKARYOTES


Caracteristici ale replicării la eucariote :Caracteristici ale replicării la eucariote Multiple origini de replicare Replicarea este bidirectională Are mai multe origini de replicare deoarece molecula de ADN este foarte lungă şi viteza de acţiune a replizomului este mică Histonele vechi se asociază cu duplexul nou care conţine catena leading.


Multiple regiuni ori la eucariote :Multiple regiuni ori la eucariote


Tabel comparativ: :Tabel comparativ:


Prima regulă a unui discurs public :Prima regulă a unui discurs public Oamenii drăguţi termină repede.