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Techniques d’identification des bactéries : 

Techniques d’identification des bactéries 5.1 les grands principes de classification :taxonomie 5.2 les méthodes phénotypiques d’identification des bactéries 5.3 les méthodes d’isolement des bactéries 5.4 les méthodes récentes d’identification des bactéries

5.1 les grands principes de classification : taxonomie : 

5.1 les grands principes de classification : taxonomie caractères phénotypiques: accessibles par des méthodes n’impliquant pas la connaissance du génome morphologie, caractères biochimiques

5.1.1 le concept d’espèce : 

Fibrobacter succinogenes : coccobacille à gram négatif, anaérobie strict, Utilisant du glucose, du cellobiose et de la cellulose comme source de carbone produisant du succinate et de l’acétate, nécessitant des acides gras volatiles pour se développer 5.1.1 le concept d’espèce Escherichia coli : bacille à Gram négatif, aérobie-anaérobie facultatif, métabolisme respiratoire ou fermentaire, mobile, oxydase négatif, catalase positif, utilisant les nitrates en anaérobiose, utilisant du glucose, du lactose et un panel d’autres sucres, n’utilisant pas le citrate, possèdant une hydrogène-lyase, produisant de l’indole, mais pas d’acétoïne, …..

Genre et espèce : 

coli : Campylobacter coli et Escherichia coli faecalis ou fecalis : Alcaligenes faecalis, Streptococcus faecalis Campylobacter fecalis, Vibrio fecalis Bergey’s manual espèces genres familles ordres classes 4 divisions royaume espèces genres familles ordres classes ou espèces genres familles ordres classes domaine espèces genres familles ordres classes espèces genres familles ordres classes Genre et espèce

5.1.2 déclaration de bactéries,collection de souches : 

5.1.2 déclaration de bactéries,collection de souches International Journal of Systematic Bacteriology International Journal of Systematic Evolution and Bacteriology Systematic and Applied Microbiology. et collections de souches. L’ATCC : American Type Culture Collection La DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Collection de l’Institut Pasteur

5.1.3 les critères de classification : 

La division I :les bactéries à Gram négatif  . La division II : les bactéries à Gram positif La division III : les bactéries sans paroi, extrêmement petites : 0,2 à 0,3µm, Mycoplasme La division IV: les Archaebactéries Les bactéries à Gram négatif ayant une importance médicale ou commerciale Les bactéries à Gram positif ayant une importance médicale ou commerciale Les bactéries à Gram négatif restantes et les Archaebactéries. Les bactéries filamenteuses et genres apparentés Classification taxonomique Regroupements pratiques Bergey’s manual 5.1.3.A La coloration de Gram 5.1.3 les critères de classification

Critères physiologiques morphologiques : 

Type respiratoire, Enzymes de détoxification des entités oxygénées réactives catalase, oxydase, superoxyde dismutase Mobilité et présence de flagelles Source de carbone Source d’azote Métabolites produits Conditions physico-chimiques de culture: pH, température, osmolarité Biotope d’origine Critères physiologiques morphologiques 5.1.3.B Les autres caractères

5.1.3.B Les autres caractères : 

5.1.3.B Les autres caractères Morphologie:

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Techniques d’identification des bactéries 5.1 les grands principes de classification :taxonomie 5.2 les méthodes phénotypiques d’identification des bactéries 5.3 les méthodes d’isolement des bactéries 5.4 les méthodes récentes d’identification des bactéries

Paroi des bactéries à Gram positif 8 nm Paroi des bactéries à Gram négatif peptidoglycane espace périplasmique Rappel structure des parois

5.2.1 Gram : 

5.2.1 Gram

5 2.2 Mobilité, flagelles : 

5 2.2 Mobilité, flagelles Objectif 100 à immersion

mobilité : 

mobilité

5.2.3.Endospores : 

5.2.3.Endospores Spores de résistance ne provenant pas de structure de dispersion Thermorésistantes Coloration : vert malachite à chaud + safranine Culture après chauffage de l’inoculum Détection par culture: chauffage du milieu inoculé pendant 10 minutes à 100°C au bain-marie et mise en culture

Sporulation 1 : 

Sporulation 1

Sporulation 2 : 

Sporulation 2

Sporulation 3 : 

Sporulation 3 Accumulation d’acide dipicholinique sous forme de sel de calcium (10 à 15% du poids sec)

5.2.4 conditions physico-chimiques1 : 

5.2.4 conditions physico-chimiques1 Domaine général de croissance entre 5 et 55°C Culture à la température de l’habitat, puis recherche des températures extrêmes 30-37 5 10 -5 20 Pseudomonas Listeria Erwinia, Leuconostoc Lactobacillus, Bacillus cereus Micrococcus cryophilus Vibrio psychroerythreus Entérobactéries Les pathogènes en général bacilles Clostridies staphylocoques Clostridium thermosaccharolyticum Bacillus stearothermophilus Desulfomaculatum nigrificans Thermus aqualiticus Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus La température

Effet de la température : 

Effet de la température température

5.2.4 conditions physico-chimiques2 : 

5.2.4 conditions physico-chimiques2 Le pH: domaine général pour les bactéries pH entre 6 et 9 Pour certaines bactéries tolérances extrêmes qui contribuent à l’identification: Thiobacillus thiooxydans tolère un pH de 0 Sporosarcina urea ne se développe qu’à pH > 8 mécanisme de régulation du pH intracellulaire

5.2.4 conditions physico-chimiques3 : 

5.2.4 conditions physico-chimiques3 Pression osmotique et activité de l’eau osmolarité Aw Pression osmotique: concentration molaire x nbre d’ions par mole si molécule ionisée NaCl x2, (NH4)2 SO4 x3 Saccharose x1

Aw NaCL, saccharose : 

Aw NaCL, saccharose

Pression osmotique : 

Pression osmotique

Slide 24: 

La pression osmotique est exprimée en osmoles

Exemples : 

Exemples Temps de génération Pseudomonas Témoin environ 55 min NaCl 100mM 62 300 mM 90 500 mM 130 Saccharose 100 mM 55 200mM 78 300mM 165

Conditions limites de vie de bactéries : 

Conditions limites de vie de bactéries Bactéries Pseudomonas E.Coli Salmonella Clostridium botulinum Listeria monocytogenes Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Saccharomyces cerevisiae Moisissures Aw Posm conc NaCl 0,97 1,7 50 g/L 0,95 3 75 g/L 0,95 0,95 0,92 4,5 135 g/L 0,90 5,5 165 g/L 0,86 7,8 236 g/L 0,90 0,70

Aw de certains produits alimentaires : 

Aw de certains produits alimentaires Tous produits animaux ou végétaux crus Aw >0,98 Sauf raisins, cerises > à,96 Confitures >0,75 Céréales > 0,70

Comportement à l’oxygène : 

Comportement à l’oxygène Milieu nutritif sans nitrate 5.2.5 le type respiratoire

FRO: formes Réactives de l’oxygène : 

FRO: formes Réactives de l’oxygène Enzymes de détoxification des entités oxygénées réactives +

Résistance des cellules : 

Résistance des cellules NADH peroxydase et glutathion réductase

Détoxification des FRO : 

Détoxification des FRO

Catalase : 

Catalase SOD: les bactéries aérobies + certaines anaérobies: Clostridium, Streptococcus Catalase: beaucoup de bactéries aérobies Pseudo-catalase chez les bactéries lactiques Eau oxygénée à 30%

Rappel respiration nitrate : 

Rappel respiration nitrate

Respiration nitrate : 

Respiration nitrate

Respiration sulfate : 

Respiration sulfate Milieu de Kligler-Hajna : sulfate de fer ferreux peptones (acides aminés soufrés)

5.2.6 type métabolique : 

5.2.6 type métabolique Milieu Hugh et Leifson: peu peptoné, gélosé, peu tamponné + bleu de bromothymol

utilisation des sucres 1 : 

utilisation des sucres 1 Peptones 15g/l NaCl 5g/l Rouge de phénol 30 mg/l pH= 7,6 Sucre X 5 à 10g/l Inoculum provenant d’un milieu solide ou liquide sans sucre Galactose Lactose, saccharose, maltose, cellobiose Arabinose, xylose Inositol, mannitol, sorbitol dextrines 5.2.7 les sources de carbone

utilisation des polyosides : 

utilisation des polyosides

citrate : 

citrate Pour des bactéries exigeantes milieu au citrate additionné de glucose 0,2g/l et d’extrait de levure 0,5 g/l 5.2.7.B les autres sources de carbone

les acides aminés : 

les acides aminés acide aminé acide organique désaminase Milieu synthétique (M63) avec un seul acide aminé qui sert à la fois de source d’azote et de source de carbone Présence ou absence de culture.

tryptophane : 

tryptophane tryptophanase

Kligler-Hajna ou TSI : 

Kligler-Hajna ou TSI Peptones Glucose 1g/l Lactose 10g/l (saccharose 10g/L) Sulfate de fer Rouge de phénol TSI= Triple Sugars Iron Agar

fixation NH4 : 

fixation NH4

assimilation des nitrates et des nitrites : 

assimilation des nitrates et des nitrites Inoculum pauvre Culture très faible

AA et protéines : 

AA et protéines acides aminés : un grand nombre de bactéries problème d’absence de perméase protéines

produits des fermentations: cas général : 

produits des fermentations: cas général Chromatographie: High pressure Liquid Chromatography Chromatographie phase gazeuse Résonnance Magnétique Nucléaire Mais pour les chromatographies possibilité de confusion entre deux métabolites si la colonne n’est pas adaptée ou évasion de certains métabolites Analyse globale sans a priori Coût très élevé en général Techniques sommaires aisément accessibles dans un labo de microbiologie Réponses globales , pas toujours précises Méthodes enzymatiques standardisées Kit de dosages commercialisés prêts à l’emploi Nécessité d’ a priori Réponse que sur les questions posées Difficulté de gestion des kits périssables

fermentations : 

fermentations

Fermentations acides mixtes : 

Fermentations acides mixtes PEP lactate éthanol acétaldéhyde pyruvate fumarate acétate succinate malate Pi acétyl~P acétyl-CoA formiate CoA oxaloacétate

fermentations : 

fermentations

Butane-diol : 

Butane-diol PEP lactate NADH +H+ éthanol acétaldéhyde pyruvate oxaloacétate malate fumarate acétate Pi acétyl-CoA formiate CoA H2 succinate pyruvate acétoïne 2,3 butane diol

rouge de méthyle et Vosges Proskauer pour les entérobactéries : 

rouge de méthyle et Vosges Proskauer pour les entérobactéries Pour les bactéries lactiques recherche de l’acétoïne seulement

esculine : 

esculine Critère majeur d’identification pour certains microbiologistes: Institut Pasteur Castanea aesculus

hydrolyse de l’urée : 

hydrolyse de l’urée -milieu de culture à l’urée -plus rapide et plus significatif: Tampon uréase: tampon phosphate 2,5mM à pH 5,8 + rouge de phénol + urée 20g/l L’urée ne doit pas être chauffée Produits d’hydrolyse des substrats azotés

décarboxylase et dihydrolases : 

décarboxylase et dihydrolases Activées à pH acides LDC, ODC, ADH milieu de Moeller extrait de levure + arginine ou lysine ou ornithine 5g/l +glucose 1g/l + bromocrésol pourpre

devenir du tryptophane et de la phénylalanine : 

devenir du tryptophane et de la phénylalanine tryptophane phénylalanine

tryptophane et phénylalanine déaminase : 

tryptophane et phénylalanine déaminase ou tampon à la phénylalanine Suspension dense incubée entre 1 et 4 heures

GALERIES MINIATURISEES : 

GALERIES MINIATURISEES

renseignements complémentaires : 

renseignements complémentaires Selon les familles de bactéries quand l’identification est déjà bien avancée Pratique de tests spécifiques Résistance au KCN Hémolyse DNAase et Thermonucléase Coagulase Résistance à certains biocides Confirmations sérologiques Pour les bactéries lactiques recours à des techniques de biologie moléculaire

Slide 59: 

Techniques d’identification des bactéries 5.1 les grands principes de classification :taxonomie 5.2 les méthodes phénotypiques d’identification des bactéries 5.3 les méthodes d’isolement des bactéries 5.4 les méthodes récentes d’identification des bactéries

Stries d’isolement : 

Stries d’isolement

Les milieux sélectifs : 

Les milieux sélectifs Caractéristiques des milieux sélectifs -présence d’inhibiteurs sélectifs -présence de composants favorisant la croissance spécifiquement -présence souvent d’agents de différenciation. Milieu d’isolement de Staphylococcus aureus : milieu Baird Parker Tryptone: 10g; extrait de levure: 1g; extrait de viande: 5g gélose: 15g Glycine: 12g; pyruvate de sodium: 20g Tellurite de potassium: 100mg; Chlorure de lithium: 5g Émulsion de jaune d’oeuf : 50 ml

Les milieux sélectifs: exemple : 

Les milieux sélectifs: exemple Colonies caractéristiques

Les techniques sélectives : 

Les techniques sélectives Utilisation de milieux non sélectifs Mais de conditions sélectives: Révélation de la présence de Bacillus thermophiles sporulants ou non Température d’incubation: 55°C pendant cinq jours Formes végétatives Formes sporulées: bain-marie bouillant à 100°C pendant 10 minutes. Gram positif, catalase positive

Bacillus thermophiles: germes d’altération de produits déshydratés : 

Etuve à 55°C pendant 5 jours Bacillus thermophiles: germes d’altération de produits déshydratés

Classification simplifiée Gram – : 

Classification simplifiée Gram – Coccobacilles ou bacilles (catalase +) Oxydase + Oxydase – Pseudomonas Aeromonas Flavobacterium Brucella Vibrio Acetobacter Azotobacter Rhyzobium Agrobaccterium Nesseria (coques, Ox+,cat+) Azospirillum Campylobacter Legionella Escherichia coli Salmonella Shigella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Proteus Serratia Erwinia Yersinia Achromobacter

Classification simplifiée Gram + : 

Classification simplifiée Gram + Micrococcus Staphylococcus Streptococcus (SOD) Leuconostoc Pediococcus Bifidobacterium Lactobacillus Mycobacterium Corynebacterium Listeria (oxydase-) Bacillus Clostridium

Sujet d’examen possible : 

Sujet d’examen possible Choisissez des tests permettant d’étudier soit le type respiratoire d’une bactérie, soit le métabolisme de cette bactérie, soit donnant des informations sur les deux , Et justifiez les conditions de test (composition du milieu, aérobiose ou anaérobiose) en fonction des voies métaboliques étudiées par ces tests. Même travail pour l’assimilation de l’azote et l’utilisation des acides aminés Rappelez les bases scientifiques théoriques qui permettent d’expliquer la lecture : du milieu de Kliger-Hajna des milieux Moeller lysine, ornithine, arginine Clark et Lubs Bouillon nitrate

fin : 

fin

Slide 70: 

Classification simplifiée Gram – Coccobacilles ou bacilles (catalase +) Oxydase + Oxydase – Pseudomonas Aeromonas Flavobacterium Brucella Vibrio Acetobacter Azotobacter Rhyzobium Agrobaccterium Nesseria (coques, Ox+,cat+) Azospirillum Campylobacter Legionella Escherichia coli Salmonella Shigella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Proteus Serratia Erwinia Yersinia Achromobacter

Slide 71: 

Pression osmotique: concentration molaire x nbre d’ions par mole si molécule ionisée NaCl x2, (NH4)2 SO4 x3 Saccharose x1

Aw >0,99 : 

Aw >0,99

UFC : 

UFC 10-1 10-2 10-3 10-4 UFC = unité formant colonie

Profils fermentaires enterobactéries : 

Profils fermentaires enterobactéries Moles de Produit/ 100 moles de glucose consommés Butane diol CO2 acétate éthanol formiate H2 lactate succinate pH: 6,5

Applications des magnétosomes : 

Applications des magnétosomes

Classification simplifiée Gram + : 

Classification simplifiée Gram + Micrococcus Staphylococcus Streptococcus (SOD) Leuconostoc Pediococcus Bifidobacterium Lactobacillus Mycobacterium Corynebacterium Listeria (oxydase-) Bacillus Clostridium

Aquaspirillum magnetotacticum : 

Aquaspirillum magnetotacticum