CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

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DESCRIBE LAS TÉCNICAS DE LABORATORIO PARA REALIZAR SEPARACIÓM DE MOLECULAS MEDIANTE ESTA TECNICA

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Cromatografía:

Cromatografía 1 CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

INTRODUCCION:

INTRODUCCION Es una metodología muy utilizada en laboratorio que permite separar y estudiar los diferentes componentes celulares por tamaño mediante centrifugación. Esto se debe realizar con una homogenización previa mediante métodos físicos ( mortero, juguera, etc.) ó por métodos químicos como el detergente. 2

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Homogeneización de la muestra Centrífuga de alta velocidad Potter

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1000 x g, 10 min 20.000 x g, 20 min 80.000 x g, 1 h (ultracentrífuga) 150.000 x g, 3 h Fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial citosol

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Comparación de la sedimentación por velocidad (A) y por equilibrio de sedimentación (isopícnica, B) 5-20%

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6 CROMATOGRAFIA Esta metodología fue desarrollada para separar pigmentos vegetales. Actualmente existen variaciones de esta técnica basados en el mismo fundamento. La mezcla a separar son disueltos en la fase móvil y se hacen migrar en una fase estacionaria el cual va a permitir la migración a cierta distancia de algunos de los compuestos pertenecientes en la mezcla dependiendo de características como el tamaño. Existen otras variables para separar la muestra dependiendo del tipo de cromatografía.

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Fundamento de la Cromatografía Muestra: tres componentes mezclados Fase móvil Fase estacionaria Se hace fluir una fase móvil sobre la estacionaria Dependiendo de la afinidad relativa por ambas fases, los componentes de la mezcla primitiva se separan Se dispone una mezcla sobre una fase estacionaria

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1. Intercambio iónico - Separa según carga eléctrica - Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble - Fase móvil: gradiente de sal o de Ph 3. Afinidad - Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado - Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble - Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre 5. Exclusión molecular - Separa según tamaño molecular - Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados - Fase móvil: solución tamponada TIPOS DE CROMATOGRAFÍA

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Cromatografía de intercambio iónico Fase estacionaria: Resina con grupos funcionales iónicos (ej. R-NH 3 + , RNR 3 + , R-COO - , R-SO 3 - ) Fase móvil: Solución acuosa Parámetros a modificar: Fuerza iónica, pH 10

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+ + + + + + + + + - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Proteínas adsorbidas al intercambiador iónico A baja concentración de sal, se desprenden las proteínas menos electronegativas A mayor concentración de sal se desprenden las proteínas más electronegativas Intercambio iónico

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Cromatografía de Afinidad Fase estacionaria: Resina con ligandos específicos (ej. sustratos, antígenos). Fase móvil: Solución acuosa. Parámetros a modificar: Concentración de ligandos (competencia) Fuerza iónica 13

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Cromatografía de afinidad

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