mycorrhiza

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林木菌根及應用技術 (Tree Mycorrhiza and Its Application Techniques) 授課教師：李明仁 教授 課程學分：2 學分 教學目標：講解林木菌根之理論，並解說其應用技術與適用場合及經濟價值，使學生充分瞭解自菌根菌之分離、鑑定、培養、及繁殖，及菌根苗之接種、培育、造林等一系列實施方法及技術，以應用林木菌根技術於造林業務。

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第一章  緒論 第二章  內生菌根 第三章  外生菌根 第四章  內外生菌根 第五章  菌根菌的分離技術 第六章  菌根菌的鑑定技術 第七章  菌根菌的培養及繁殖技術 第八章  菌根苗木之接種與培育技術 第九章  菌根苗之接種 第十章  菌根苗之培育、造林 授課內容

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平時成績30% (含平時測驗、實驗報告、及讀書報告)、期中考試30%、及期末考試40%。 成績評量標準

林木菌根的定義 : 

林木菌根的定義 1.林木菌根為真菌與林木根部的共生體，真菌寄生於林木的根部，真菌對林木無致病性或僅有很低的致病性。 2.宿主(host)與菌根菌(mycorrhizal fungi)生活在一起，形成共生關係(symbiotic relationship)。通常，二個伙伴自此組合(共同體, mutualism)獲得利益。 3.宿主植物獲得礦物質養分，而真菌取得由宿主植物光合作用產生的碳水化合物。

二、林木菌根的特性 : 

二、林木菌根的特性 1.林木菌根的外觀變異很大，有些菌根與非菌根有很大差異，有些則無明顯區別而只能用顯微技術來分辨。 2.大多數的林木都有菌根，有些林木若無菌根則無法生長發育。苗木(特別是松苗)若無足夠的菌根，則出栽後常無法生存。 3.在大自然中菌根者是正常的現象，而無菌根者為不正常現象。

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三、菌根組合的類型 1.囊叢枝菌根(Vesicular-arbuscular mycorrhizas, VAM)：與接合菌類(Zygomycete fungi)共生，產生叢枝體、菌絲、及囊狀體於根部皮層細胞中。 2.外生菌根(Ectomycorrhizas, ECM)：與擔子菌類(Basidiomycetes)及其他菌類共生，形成菌氈(mantle)包於根外，並於根部細胞間形成哈替氏網(Hartig net)。 3.蘭科菌根(Orchid mycorrhizas)：於蘭科植物根或莖部細胞內形成菌絲圈。

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4.杜鵑類菌根(Ericoid mycorrhizas)：於杜鵑類 植物根毛部細胞內形成菌絲圈。 5.外內生菌根(Ectendomycorrhizas)、楊梅類菌 根(Arbutoid mycorrhizas)、水晶蘭類菌根 (Monotropoid mycorrhizas)：能在細胞內形 成網狀菌絲，也能在細胞外形成哈替氏網。

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雲葉根圈土壤分離出叢枝菌根菌Sclerocystis pachycaulis 之孢子型態 （橫線＝30μm）

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雲葉根圈土壤分離出叢枝菌根菌Sclerocystis rueiformis之孢子型態（橫線＝30μm）

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雲葉根圈土壤分離出叢枝菌根菌Acaulospora sp.之孢子型態（橫線＝30μm）

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未接種菌根菌台灣櫸苗木根部表面 (橫線=120 um)

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台灣櫸苗木根部接種後形成菌根之情形 (橫線=60um)

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  接種菌根菌台灣櫸苗木根部表面(橫線=120 um)

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接種菌根菌台灣櫸苗木根部組織微細構造(橫線=12 um)

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菌根的特徵 菌根種類 菌毯 哈替式網 細胞間菌絲 細胞內菌絲 (Mycorrhizal group) (Sheath) (Hartig net) (Intercellular hyphae) (Intracellular hyphae) 外生菌根     (Ectomycorrhizas； Sheathing mycorrhizas) 囊叢枝菌根     (Vesicular-arbuscular mycorrhizas) 蘭花菌根     (Orchid mycorrhizas) 杜鵑類菌根(Ericaceous mycorrhizas) 1.杜鵑菌根     (Ericoid mycorrhizas) 2.楊梅菌根     (Arbutoid mycorrhizas)

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共生(symbiosis)：菌根與植物組合時對宿主(host)組織很 小或無傷害。菌根菌產生細胞外酵素的能力有限，而且 大都依賴單醣類如葡萄糖、果糖、木糖。 寄生(parasitism)：寄生菌生長於動植物活組織的表面或 內部。許多寄生菌將寄主組織破壞而獲得養分。寄生菌 被稱為病原因為它引起寄主病害，它分泌大量的不同 酵素 (如果膠水解酵素、纖維分解酵素、及蛋白質分 解酵素)至寄主體內，而且破壞組織。寄生菌可利用 複雜的多醣類包括澱粉及纖維素。 共生(symbiosis) 及寄生(parasitism)

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腐生(saprophytism)：腐生菌可生長在死的植 物殘骸，它可分解吸收植物殘骸所含的； 或吸收從活的或死的生物擴散出來的可溶 性有機化合物。 大多數的寄生菌能生活在死的寄主或生物， 稱為兼性寄生菌 (Facultative parasites)。 有一些寄生菌僅生長在活的植物寄主組織， 稱為絕對寄生菌 (Obligate parasites)。 腐生(saprophytism)

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1. 有些真菌是絕對共生菌(Obligate symbionts)。 2.可以用培養基培養的真菌並非必然可在野外 以腐生存活。 3. Armillaria mellea 及 Rhizoctonia solani 是蘭 花的菌根菌，也是某些林木及植物的腐生菌 。

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土中孢子(spores in soil) 根外菌絲(external hyphae) 菌根根系(mycorrhizal roots) 寄主根部分泌物 (exudates of host roots) 菌絲接觸根部 感染根部 (hyphae contact roots) (infection to roots) 菌絲擴展 叢枝體(arbuscules) (spreading of hyphae) 囊包 (vesicles) 根內菌絲(internal hyphae) 囊叢枝菌根(VAM)的感染過程

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1.Carbohydrate absorption (碳水化合物的吸收)：VAMF可吸收簡單的碳水化合物。吸收的碳水化合物主要集中於菌根細胞的油滴中、細胞壁中、及protein, organic acids, and amino acids. 2.Phosphorus absorption (磷的吸收)：VAMF可利用有些難溶性磷，如磷酸鈣(Ca3(PO4)2)、磷灰石、磷礦粉、骨粉等。菌根對磷的吸收影響機制如下： (1)根外菌絲：增加接觸點、擴大吸收面積、縮短磷的擴散距離。 (2)菌根根系對磷的吸收速率快。 (3)寄主根部分泌物改變土壤之pH值，有利磷吸收。 (4) 菌根加速寄主根部內磷的流動速率。 3.Nitrogen：菌根菌能促進N的吸收。 4.Mineral nutrients：菌根菌能促進Zn, Cu, Mg, Fe, S, Ca的吸收與轉運。 內生菌根的生理特性

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1.宿主的有效性：要形成VAM需要有效的宿主植物(host plant)存在。不能形成VAM的植物，大多數是因為其 根系會分泌不利VAM菌生長的物質。大多數植物的分 泌物對VAM菌之生長有刺激作用，而少數植物的分泌 物對VAM菌之生長有抑制作用。 2.有效的菌根繁殖體：VAM菌對宿主植物有選擇性 (selectivity)，或出現相當程度的專一性(specificity)。 所以VAM的形成也需要適合的 VAM菌種，才能接種 成功。 影響內生菌根形成的因子

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(1)土壤溫度：不同的VAM菌種其孢子發芽的最適溫度(optimum temperature)也不同，晝夜溫度對VAM菌的產孢量也有很大的影響。掌握不同的VAM菌種生長的最適溫度，可以有效提高人工接種的成功率，並加速VAM菌的繁殖速度。 (2)土壤pH：不同的VAM菌種其孢子發芽及菌絲生長的最適酸鹼度也不同，也影響土壤中主要物質及毒素的可溶性。Glomus mosseae在pH 5.3土壤中即很難生存。所以在不同的土壤pH 條件，應選用適宜的VAM菌種。 (3)土壤光照：不同的VAM菌種對光照條件的要求也有差異。以洋蔥為例，低光度(5-10 klux)有利VAM菌的感染；然而高光度則有利VAM菌的產孢。 3..適宜的環境條件 影響內生菌根形成的因子(續)

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(4)土壤養分：土壤肥力(N, P)較低時，VAM菌的孢子產 量較多。 培養VAMF人工介質的條件，一般以蛭石、泥炭土、 及河沙，以1：1：2體積比混合的材料，作為培育苗 木的介質，對VAM的形成較佳。因為這樣的介質其 保水性、滲水性、及通氣性均較好。 (5)光照：光照不是VAM形成的直接因子，但光照對宿 主植物的生長有利，宿主植物生長良好，根部生成 的菌根也就較多。 影響內生菌根形成的因子(續)

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1.將土倒入鋼桶中,以強勢水流沖洗至8分滿水位,再靜置20秒(讓大顆粒沈澱)。 2.將水溶液倒入3個疊好的篩網 (上60 mesh；中270 mesh；下400 mesh)。 3. 將上層濾篩物(sieving)洗入小燒杯中。將中、下層濾篩物洗入另一小燒杯中。 4.將上層濾篩物溶液，直接在顯微鏡下檢視是否有孢子存在。 5.將中、下層濾篩物溶液移入離心管中，以純水加至對稱離心管等重後，離心(2,000-3,000 rpm，3-4 分鐘)。 6.將上層液丟棄，倒入40%或50%糖液至對稱離心管等重後，離心(2,000-3,000 rpm，1.5-2 分鐘)。利用抽氣漏斗，將一張濾紙放在抽氣漏斗上，吸取糖液，加入濾紙上(儘量置中)，最後再用純水沖洗一下濾紙，使糖液別殘留過多，即可於顯微鏡下檢視是否有孢子存在。 叢枝菌根國際網站 http://invam.caf.wvu.edu/# 分離內生菌根菌孢子的方法

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1.洗淨植物根部，切成1cm長的段落。固定在FAA固定液 中1小時。 2.將根浸於10%(或2.5%)KOH溶液中，隔夜。(較嫩的根可用2.5%)。 3.以蒸餾水連續洗三次。 4.若根是深色顏色者，以AlkalineH2O2溶液在室溫下浸泡根部30min，或直到根部變白為止。 5.以蒸餾水連續洗三次。 6.將根浸於1% HCl溶液中，5min。(可延長至2天) 7. 將根浸於0.01% acid fuchsin-lactic acid staining slon.溶液 中，加熱至90℃，20mins。 內生菌根染色法

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FAA：Formalin 13ml Acetic Acid(Glacial) 5ml Ethyl Alcohol(50%) 200ml  Alkaline H2O2：NH4OH 3ml (新鮮配製為宜) H2O2(10%) 30ml Tap water 567ml  染色劑(一) 0.01% acid fuchsin-lactic acid staining solution： Lactic Acid 875ml Glycerin 63ml Tap water 63ml Acid fuchsin 0.1g  染色劑(二) acid glycerol solution(500ml glycerol + 450ml H2O + 50ml 1% HCl + 0.5g Aniline blue) 去色液：acidic glycerol(500ml glycerol + 450ml H2O + 50ml 1% HCl)  *若是要用來照相，以Aniline blue染劑進行染色；若要計算感染率則以Acid fuchsin染劑 內生菌根染色法染劑配方

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囊叢枝內生菌根的形態特徵及構造 一、包囊(Vesicles)：為菌絲體頂端膨大形成的構造。 二、叢枝體(Arbuscules)：VAMF菌絲侵入林木的根部皮層細胞內，並在細胞內連續進行分枝形成叢枝狀結構。 三、內生菌絲(Internal hyphae)：外生菌絲通過林木根部的表皮細胞或根毛，侵入皮層組織內部細胞生長形成的菌絲。內生菌絲無隔膜，有利於輸導養分。部分內生菌絲的頂端膨大形成包囊，也有的形成叢枝體。 四、外生菌絲(External hyphae)：在根外生長的菌絲。 五、孢子及孢子果(Spores and Sporocarps)：為VAMF的繁殖器官，著生於外生菌絲上，常分佈於土壤中。孢子一般為圓形、橢圓或卵形，內含油滴，直徑約100  200 m之間，最大者可達500 m。有些菌種可形成孢子果，孢子果內的孢子呈串珠狀或幅射狀排列，孢子果直徑約1 mm  1 cm。孢子在土壤中的壽命約1年。

囊叢枝內生菌根的形成過程 : 

囊叢枝內生菌根的形成過程 病原微生物入侵寄主植物的活動叫侵染（infection），其過程稱為侵染程序（infection procedure）。 菌根現象即是植物與微生物達到高度統一的種特殊寄生現象，因此，其侵染的過程也是一致的。植物病理的侵染程序包括4個過程：即接觸、侵入、擴展和出現。

囊叢枝內生菌根感染長度之測定 : 

囊叢枝內生菌根感染長度之測定 建立植物根系被叢枝內生菌根菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）感染之長度，有很多的方法可利用，詳見Kormanik與McGRraw（1982）所述。格子線交叉法（The gridline intersect method）為一較便利的方法，可同時建立所觀側根系總長度與受感染之根長（Giovannetti與Mosse，1980），可進一步於測數感染根系數時，同時觀測菌絲著生強度（intensity），評估根系內菌絲量。於15×15cm2的透明膜（通常用完全透光的塑膠膜）上畫0.5英吋之方格備用。

囊叢枝內生菌根感染長度之測定 : 

囊叢枝內生菌根感染長度之測定 另將已染色的根系置入培養皿內，將格子線透明膜置放在培養皿之下方，置顯微鏡上觀測。觀測時培養皿之上與左緣務必與格子線相截，而後由上而下，由左而右，側數根系與格子線交叉點的數目，記錄總觀側之點數（a）及其中被菌絲感染之點數（b）。或用10×20倍之顯微鏡更詳細觀測根內菌絲密度，依根內菌絲量分成五級（Christie等，1978）既未感染為【0】，感染面積佔根面積25﹪以下為【1】，26-50﹪為【2】，51-75﹪為【3】，越過75﹪則為【4】。計算方法如下：

囊叢枝內生菌根感染長度之測定: 

囊叢枝內生菌根感染長度之測定 A、感染率 ＝ b/a×100﹪ B、感染強度 ＝ 0 ×V＋1 ×W＋2 ×X＋3 ×Y＋4 ×Z V＋W＋X＋Y＋Z V： 於交點上不含菌絲之根段數。 W. X. Y. Z.依次為交叉點上所觀測到的根段，菌絲所佔之面積分別為25﹪以下，26-50﹪，51-75﹪及75﹪以上。

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囊叢枝菌根菌之研究方法 VAM的調查與取樣 採取帶有林木根系的根際混合土壤樣本：因為VAM一般分佈在030cm的土壤層中，且大多數與營養根共生。 應記錄海拔高、地形、氣候及植被、土壤類型、宿主及附近植物的種類及生長發育情況。 分析項目：土壤類別、土壤性質、溼篩結果、菌種鑑定初步結果。 一些VAM的較大孢子果分佈在枝葉層下面的土壤表層，因此採取土壤樣本時，應注意勿將表層土壤與枝葉層一道拋棄。

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VAMF之篩選 1.     濕篩傾倒法(wet-sieving and decanting method) 2.     密度梯度離心法(density gradient centrifugation) 3.     單孢分離法(single spore isolation) III. VAMF之觀察 1.     VAMF之種類及數量 2.     VAMF之分佈情形 3.     VAMF之孢子量測定 4.     VAMF之族群頻度 (1)優勢種：族群頻度＞50% (2)常見種：族群頻度＞30%50% (3)少見種：族群頻度＞10%30% (4)偶見種：族群頻度＜10% 囊叢枝菌根菌之研究方法(續)

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囊叢枝菌根菌之研究方法(續) 5. 植株對VAM之依賴性(mycorrhiza dependence) ：接種苗木的乾重/未接種苗木的乾重。 MD(菌根依賴性，%) = 【接種菌根苗木的乾重(M1) ÷未接種菌根苗木的乾重(M0)】×100% 百分數愈大，表示該苗木對VAM的依賴性較強。一般菌根依賴性可分三級，MD = 300表示依賴性較強，MD = 200表示依賴性中等，MD = 100表示依賴性較弱或無依賴性。不同植物種類在不同的土壤狀況下，其VAM的依賴性也可能不一致。

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6. VAMF菌種樣品的保存 VAMF菌種樣品一般以土壤樣品保存，用塑膠袋或布袋包裝，於常溫或低溫條件下保存，但以5℃的條件下保存的效果較佳。VAMF菌種樣品保存在宿主植物根段上的生活力，比保存在土壤中的生活力為佳，保存期也較長，保存在宿主植物根段的VAMF菌種，在5℃下保存6個月，不致喪失其侵染力(infectivity)。保存1年後，其侵染力仍可達40%的水準。一般以土壤保存的VAMF菌種樣品，應盡量在6個月內使用，保存超過6個月者，應盡量利用盆栽法繁殖後，再使用於接種。 AOPEN USER: 囊叢枝菌根菌之研究方法(續)

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VAM 侵染的觀察 1. 根樣的採集：選取幼根，剪成1cm長的根段，以FAA固定液固定備 用。 2. 根樣的染色：以Phillips and Hayman 染色法染根段。 3. VAM感染率的觀測 (1)估測法：迅速但不精確。將根段以解剖針鋪平後，以解剖顯微鏡 40100倍觀察，估測整個根系被VAMF感染的營養根的數目。 1級：被感染的營養根佔觀察總根數的05%。 2級：被感染的營養根佔觀察總根數的625%。 3級：被感染的營養根佔觀察總根數的2650%。 4級：被感染的營養根佔觀察總根數的5175%。 5級：被感染的營養根佔觀察總根數的76100%。

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VAM 侵染的觀察(續) 也可以感染的多少及強弱，評估其感染強度，其標準如下： 1. 感染強度弱：根段中的VAM叢枝體及包囊數量很少，分 佈稀疏。 2. 感染強度中：根段中的VAM叢枝體及包囊數量很多，分 佈均勻，但尚未連接成片。 3. 感染強度強：根段中的VAM叢枝體及包囊分佈密集，常 連接成片。 (2)感染長度計算法 1. 取30100條根段，觀察之。 菌根感染率(%) = 【VAM感染的毫米(或視野)數÷檢查 根段的總長度(mm) (或總視野數)】×100%

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VAM 侵染的觀察(續) (3)菌絲體長度的觀測 林木根系周圍打孔取樣，稱取5g土壤放入燒杯中浸泡，用 240mesh篩洗，過濾物放於培養皿中，用Trypan blue 染色30min ，再過篩，沖洗，再以9cm之濾紙過濾，於顯微鏡下觀察菌絲的 長度。 R = NA/2H R：菌絲體長度(mm) N：目鏡上的劃線與菌絲相切的菌絲總數 A：培養皿的面積 H：視野直徑

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內生菌根的生理機制 一、礦物質養分的吸收 1.土壤中磷的吸收利用 (1)土壤溶液中的可溶性無機磷 (2)不溶性無機磷 (3)有機磷 VAMF之吸收能力與體外菌絲有密切關係。體外菌絲可吸收磷酸 鹽。

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體外菌絲的原生質膜 叢枝體的原生質膜 宿主的原生質膜 (plasmalemma of external hypha) (plasmalemma of arbuscule) (plasmalemma of host cell) 界面真菌生長基物   Interfacial matrix  寄主 磷酸鹽 菌絲轉移 磷酸鹽Pi 磷酸鹽 Pi (soil) Hyphal translocation host Pi 主動 系統 被動 系統 主動 系統 Active mediated Passive mediated Active mediated   界面真菌生長基物  真菌碳水化合物 葡萄糖及其他糖類 Fungal carbohydrate 主動系統 被動系統 Active mediated Passive mediated 磷酸鹽(Pi)及碳水化合物在囊叢枝菌根系統中輸送的可能途徑

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  2. VAMF可將不溶性無機磷，予以溶解。 3. 磷對VAM感染的效應 缺磷植物 富磷植物 土壤有效磷低 土壤有效磷高 根含磷量低 根含磷量高 內生菌根的生理機制

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細胞膜控制的磷抑制菌根感染的模式 根細胞膜之磷脂量減少 根細胞膜之磷脂量增加 根細胞膜之滲透力增加 根細胞膜之滲透力減少 根滲漏出之還原糖及氨基酸增加 根滲漏出之還原糖及氨基酸減少 菌根形成增加 菌根形成減少

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4. 氮養分的吸收：感染VAMF的植物一般較無VAM 者，其組織之含氮量較少。然而，也有研究結果顯 示，感染VAM之植物較無VAM者，其地上部有較 多的氮。此可能是經由菌絲的輸送，而增加氮的吸 收。 內生菌根的生理機制

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1. 樹種選定及菌種取樣    2. 優勢囊叢枝菌根菌的篩選    3. 優勢囊叢枝菌根菌的培養、增殖及接種    4. 菌種量產及苗木培育    5. 造林試驗 試設計選育一本土樹種可用的優勢囊叢枝菌根菌的試驗計畫

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1. Resistance, Tolerance  2. Stress: drought, salinity, heavy metals (Pb, Cu, Zn, Cd, Hg)  3. Experiment Methods  (1) drought resistance   (2) salt tolerance (3) heavy metal tolerance VAM苗木之抗逆境研究

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囊叢枝菌根VAM苗木之抗逆境研究 VAM苗木之抗逆境研究

外生菌根苗的合成培養 : 

外生菌根苗的合成培養 1.目的：以無菌發芽的幼苗供作合成菌根的目的有：(1) 判定真菌形成菌根的能力，(2) 檢驗真菌對宿主植物的專一性，(3)篩選最適的外生菌根菌種或品系，以形成大量的菌根促進苗木的生長。 2.限制因子：(1) pH， (2) 根長， (3) 年齡。 3.菌索及菌毯型態的研究方法 利用一支直徑為3235 mm，長為30 cm的試管，內襯濾紙並加液態培養基，可培養松樹苗1216個星期。 此一試管技術有利於外生菌根的組織生化學研究，如澱粉、及其他多醣類、酚類化合物、及多磷酸鹽類。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) 4.幼苗形態的研究 在大多數的針葉樹苗圃，直播後一年會自然形成菌根。在第二年的苗圃，常會發現子實體。 5.外內生菌根：在松樹及落羽松的苗圃中，幼苗常會發生粗的細胞間菌絲網及疏的菌毯，以及粗的細胞內菌絲佔據長根的皮層細胞，即所謂的E-strain 外內生菌根(ectendomyorrhizl association)。 6.反常的感染：有時菌根菌並無法全部感染所有短根。未被感染的根會進行皮層崩解，或被非菌根真菌侵害。根部皮曾細胞或軟木質(suberins)會被單寧(tannins)填滿，破壞其細胞的功能。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) 1.不同菌根的殖育行為：Hartig net 是菌根發育的最可靠指標。菌毯則較不可靠，因為菌毯會隨根的直徑及真菌的活性狀態而改變。 2.菌根發育與根群生季節及季節間生長的關係：主根及側根生長的差異。 3.苗木取樣的方法：挖掘完整的初級根及側根。 Time of Sampling: sample nursery bed at weekly intervals during the first growing season, and at two-week intervals during the second. 取樣時間：在第一生長季，隔週自苗床取樣；在第二生長季，隔二週自苗床取樣。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) a. Recording and Measurement of Morphological Features: Portions of root systems for study can either be photographed or photocopied. 記錄及測量外形特徵：照相或影印部分根系。 b.Extensive development of ectomycorrhizae may inhibit the elongation of long roots and transform probable long root primordia into mycorrhizae, whereas ectendomycorrhizal development appears to have little effect on lengths and numbers of long roots. 外生菌根的大量發育會抑制長根的延伸，並改變可能的長根生長點成為菌根，然而外生菌根的發育，對長根的長度及數目的影響很小。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) d.清理根群供研究真菌感染類型：儲存根群於FAA(formalin-acetic acid-alcohol)。若根群不易漂白，可用雙氧水及KOH反複進行漂白，直到漂白為止。 徒手及切片法研究菌根解剖學：徒手或切片菌根組織，固定於載玻片，加乳酸或乳酸酚及少量的棉花藍(cotton blue)，以篩選外生菌根或外內生菌根。Safranin, crystal violet, fast green, and gold orange in the Conant stain yields slides, which are excellent for study purposes but do not photograph well with black and white panchromatic film.

森林外生菌根(ECM)的取樣技術: 

森林外生菌根(ECM)的取樣技術 a.取樣筒直徑2.5 cm，取樣深度7 cm。在腐植質層中間的根群密度最高，平均為每立方公分 31 個根尖。 b.挖掘 A1 及 A2 土壤礦質土以暴露分支的根群 c.森林菌根取樣期：(1) 春天，(2) 晚夏或早秋。 d.外生菌根型：Pinus：二叉分枝式(dichotomous branching)，並發育成珊瑚狀(coralloid)或根瘤的(nodular)構造。大多數的外生菌根宿主形成羽狀(pinnate)或總狀(racemose)分叉。 e.外生菌根的特徵：(1)菌毯包複根部，(2)菌絲穿透於皮層細胞間並形成Hartig net，(3)皮層細胞被Hartig net 包圍並呈輻射狀放大，(4)具有根毛及根冠。 f.菌毯及Hartig net 是以立體顯微鏡及徒手或切片技術來觀查的。

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi : 

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作 Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi I.外生菌根菌之分離(Isolation of Ectomycorrhizal Fungi) Ectomycorrhizal fungi are most commonly isolated from sporocarp tissue, but can also be isolated from surface sterilized ecotomycorrhizae, sclerotia (菌核), rhizomorphs (菌索，根狀體), and in some cases, from sexual spores. 外生菌根菌通常由孢子果組織來分離，但是也可由經表面消毒的菌根、菌核、菌索、及有性孢子來分離。 A.Sporocarp isolation is generally preferred because species can be identified and little pretreatment of fungal material is required. 通常喜歡採用孢子果來分離，因為菌種較易鑑定，且真菌材料所需的預備處理較少。 Ectomycorrhizal fungi can differ strongly in ease of isolation from sporocarps and growth in culture. 外生菌根菌自孢子果分離及培養生長的難易度，有很大的差異。

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi : 

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作 Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi I.外生菌根菌之分離(Isolation of Ectomycorrhizal Fungi) Ectomycorrhizal fungi are most commonly isolated from sporocarp tissue, but can also be isolated from surface sterilized ecotomycorrhizae, sclerotia (菌核), rhizomorphs (菌索，根狀體), and in some cases, from sexual spores. 外生菌根菌通常由孢子果組織來分離，但是也可由經表面消毒的菌根、菌核、菌索、及有性孢子來分離。 A.Sporocarp isolation is generally preferred because species can be identified and little pretreatment of fungal material is required. 通常喜歡採用孢子果來分離，因為菌種較易鑑定，且真菌材料所需的預備處理較少。 Ectomycorrhizal fungi can differ strongly in ease of isolation from sporocarps and growth in culture.

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi : 

外生菌根(ECM) 之分離、保存、及純培養操作 Isolation, Maintenance, and Pure Culture Manipulation of Ectomycorrhizal Fungi II.  孢子果的採集(Collection of sporocarps) A.  Young sporocarps are preferred for direct isolation. 年輕的孢子果較常被採用，作為直接分離用。 Fully matured specimens should also be collected so that species can be reliably determined. 也應採集完全成熟的孢子果，以利可靠地鑑定菌種。 B. Place sporocarps into waxed paper bags or wrap in waxed paper to retard drying (avoid plastic bags because sporocarps deteriorate rapidly in a “non-breathing” container).將孢子果裝於蠟紙袋中，以減緩乾燥(避免用塑膠袋，因為孢子果在無法呼吸的容器中，會快速劣化)。 C. In the case of mushrooms, cut the stem from a mature specimen in good condition, place the cap over a white card, cover with waxed paper, and lay cap over card flat in the collection container to obtain a spore print. 若是菇類，將蕈柄切除，置蕈帽於白紙上，加蓋蠟紙，並置入採集器中，以取得孢子印。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) E.野外採集回來後，應盡快完成分離工作，則結果較佳。 F.若採集後，需待數日後方能進行離工作，則需將樣本冷藏(3-5℃)。 G.當外生菌根菌被建立於洋菜培養基上，且無污染，則應切取菌落的邊緣，用轉移針在無菌狀況下，轉移至新鮮的培養基，建立菌種。外生菌根菌在培養基生長良好者，可以在3-4週進行第一次繼代培養。生長緩慢的外生菌根菌，可在2-4月進行繼代培養，但常在以後的培養中消失。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) H. Bacteria and several “weed” fungi (Trichoderma 木霉, Aspergillus 曲霉, Penicillium 青霉, yeast spp.) are the most common contaminants and are easily detected by presence of a glistening bacterial slime or characteristic fungus conidia. 細菌及數種雜常會造成污染，這很容易從發亮的細菌黏質，或特有的真菌分生孢子來偵查。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) 必需進行菌根合成，以確認第一次所分離到的菌種是所要的菌種，而且它可形成外生菌根。

自外生菌根分離(Isolation from ectomycorrhizae): 

自外生菌根分離(Isolation from ectomycorrhizae) 用清水沖洗根群，以清除殘留物。 置小根於透氣的塑膠試管中，內加弱清潔劑溶液，劇烈震盪3分鐘(可在第二步驟之中或前，於水浴內進行超音波震盪，以鬆脫表面殘留物)。 用清水沖洗清除清潔劑。 浸於100 ppm 的氯化汞液中4分鐘，或30%的過氧化氫液中5-20秒鐘。

外生菌根(ECM): 

外生菌根(ECM) 立即用2L無菌水沖洗。 無菌地轉移外生菌根(或菌索塊)，入於試管培養基或平板培養基中。

外生菌根(ECM)菌種的保存(Maintenance in culture): 

外生菌根(ECM)菌種的保存(Maintenance in culture) 當外生菌根菌必要培養好幾年，菌種常貯存於試管斜面培養基(13 × 100 mm螺旋蓋試管含3 ml 洋菜)，於冷藏狀態(3-5℃)，最常用MMN培養基，但有時也用 PDA培養基。 每一分離株每3-4個月繼代培養一次，繼代培養培育於20℃(通常約1-2週待菌絲體確實建立於洋菜上)，再馬上置入於冷藏直至下一繼代期。 Marx及Daniel二氏強調許多外生菌根菌在長期貯藏於生長狀態後，會改變其生長習性並喪失形成外生菌根的能力。然而，他們發現許多外生菌根菌，可以被儲存於無菌的冷水中，長達3年或更久。外生菌根菌先培養於平板培養基中，再切取菌落邊緣8 mm直徑的洋菜塞，然後將10-15個洋菜塞，在無菌狀態下移入於內含25 ml無菌蒸餾水的2.5 ×15 cm 的螺旋蓋試管中，並於5℃暗相中貯藏。

外生菌根(ECM)菌種的保存(Maintenance in culture): 

外生菌根(ECM)菌種的保存(Maintenance in culture) 菌種保存的每一分離株必須建立完整的記錄。重要的數據包括鑑別號碼、分離來源(孢子果、外生菌根、菌索等) 、分離日期、種的鑑定者與標本號碼、相關宿主、採集地點及棲地型、及最佳的貯存培養基與條件。

生長於純培養基(Growth in pure culture) : 

生長於純培養基(Growth in pure culture) Nutrients(養分) Meelin-Norkrans Semisynthetic (半合成) Synthetic (合成) Nutrients MN nutrient solution MMN (Marx, 1969) Palmer & Hacskaylo (1970) Malt Extract 3.0 g d-Glucose 2.5 g 10.0 g 5.0 g NH4Cl 0.5 g (NH4)2HPO4 0.25 g 0.25 g KH2PO4 0.5 g 0.5 g 0.5 g MgSO4.7H2O 0.15 g 0.15 g 0.5 g CaCl2 0.05 g 0.05 g FeCl3 (1%) 1.2 ml 1.2 ml (1% solution) or substitutes 0.02 g Sequestrene NaCl 0.025 g 0.025 g Biotin 5.0 µg Thiamine 1.0 mg Thiamine HCl 25 µg 100 µg Micronutrients ＊2 ml/l Bacto-agar (optional) 15 g Distilled H2O to 1,000 ml to 1,000 ml pH after autoclaving 5.5 - 5.7 4.5 – 4.7

外生菌根(ECM)培養基(Culture medium): 

外生菌根(ECM)培養基(Culture medium) 1.Micronutrient soulution：dissolve Fe(NO3)3 .9H2O at 1.45 mg, ZnSO4.7H2O at 0.88 mg, and MgSO4.H2O at 0.41 mg in 700 ml of distilled water, acidify with H2SO4 to give a clear solution, and dilute to 1,000 ml with distilled water. 2. Potato dextrose (PD) formula is: 22 g of potatos in 178 g distilled water, add 20 g d-glucose followed by agar if desired, stir well, and autoclave for 20 min. 馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基：Potatoes (w/o skins and cut up) 200 g, Glucose 20 g, Agar 15 g, Water 1000 ml.

外生菌根(ECM)培養基(Culture medium): 

外生菌根(ECM)培養基(Culture medium) Gelling with 2 + 0.5% agar of various purities has advantages for routine propagation. Growth of some fungi can be initiated or accelerated in aerated particulate substrates such as mixtures of vermiculite ± peat. 以20.5%的洋菜凝固對一般例行培養有利。有些真菌的生長在通氣的基質，如蛭石與泥碳土的混合物，可以得到促進。

純培養外生菌根合成(Pure culture ectomycorrhiza synthesis) : 

純培養外生菌根合成 (Pure culture ectomycorrhiza synthesis) 1. Synthesis apparatus(合成器具) Melin used flasks containing sterile sand moistened with a nutrient solution into which an aseptically germinated seedling and single fungus culture were introduced. 梅林氏使用盛有以營養液潤濕的滅菌沙的燒瓶，內移植入一株無菌發芽的小苗，及單一菌株。

純培養外生菌根合成(Pure culture ectomycorrhiza synthesis) : 

純培養外生菌根合成 (Pure culture ectomycorrhiza synthesis) 1. Synthesis apparatus(合成器具) Hacskaylo greatly improved the system by using vermiculite instead of sand as the substrates. Vermiculite provides better aeration and moisture holding capacity than sand.海克斯凱洛氏大大地改進此一系統，以蛭石取代細沙作為基質。蛭石比細沙能提供較好的通氣性及保濕力。

純培養外生菌根合成(Pure culture ectomycorrhiza synthesis) : 

純培養外生菌根合成 (Pure culture ectomycorrhiza synthesis) 1. Synthesis apparatus(合成器具) Zak mixed 840 ml of vermiculite with 60 ml of finely ground peat moss in the flask, moistened this substrate with 550 ml of MMN nutrient solution, capped the flask with an inverted glass having a cheesecloth-wrapped cotton plug cemented to the bottom, and autoclaved the assembly for 45-60 min at 120℃. Final pH is around 5.0. 薩克氏混合840 ml的蛭石與60 ml磨細的泥碳土於燒瓶中作為基質，以550 ml的MMN營養液潤濕之，再以紗布包棉花塞黏於玻璃杯倒蓋之，並將整組器具於120℃高溫高壓滅菌45-60分鐘。最終pH大約為5.0。 。

外生菌根菌接種原的生產 : 

外生菌根菌接種原的生產 一、土壤接種原(soil inoculum) 1.The most widely used natural inoculum, especially in developing countries, is soil or humus from established pine plantations. 最廣泛使用的天然接種源，是松樹成林的土壤或腐植質。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 2.This soil inoculum is either mixed into the rooting medium (usually a 5 to 10 percent volume), broadcast 0.5 to 1 cm deep onto soil and water into the soil around young seedlings, or suspended in water (1 kg soil in 20 l of water) and pour onto seedlings. The latter two procedures are usually done three to four times during the nursery season. 此一接種源被混合於生根介質中(通常510%)；撒佈於0.51公分深的土中，並澆水於幼苗周圍的土壤；或懸浮於水中(1公斤土壤於20公升水中)並倒入苗木根部。在苗圃季節，後二個步驟常被實施三至四次。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 3.Better results are obtained with freshly collected soil than with soil collected and stockpiled for several months. 新鮮收集的土壤，其效果比已收集堆積數月之久的土壤的效果要好。 4.Tree seedlings with ectomycorrhizae or excised ectomycorrhizae have also been used as an inoculum source for new seedling crops. 具有外生菌根的苗木，或剪下的外生菌根，也曾被用作新苗木的接種源。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 5. In France, a truffle-producing fungus, Tuber melanosporum, has been established in nursery beds of young seedlings by transplanting seedlings with Tuber ectomycorrhizae formed under laboratory conditions into the nursery bed of new seedlings. 在法國，一種生產塊菇的真菌- 松露菌(Tuber melanosporum)，已經藉由移植在實驗室條件下形成的塊菌(Tuber)外生菌根苗木，至新培育苗木的苗圃，來接種於新苗床。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 6. In some other countries, pine seedlings with abundant ectomycorrhizae are planted at 1- to 2- m intervals in new seedbeds. The extramatrical mycelium (外表生菌絲) developing from the “nurse” seedlings infect roots on the younger seedlings. 在有些國家，移植具有大量外生菌根的松苗，以1至2公尺的距離栽植於新苗床。從”肥料”苗發育出來的外表生菌絲，會感染幼苗的根。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 二、孢子接種原(spore inoculum) 1.Whole or chopped sporophores are dried before use.使用前，先將整個或切碎的孢子果乾燥。 2.Gastromycetes, such as the puffball-producing genera Rhizopogon (鬚腹菌屬), Scleroderma (硬皮馬勃屬), Pisolithus (豆馬勃屬), produce numerous basidiospores that are easier to collect in large quantities than those of mushroom-produced ectomycorrhizal fungi. 腹菌類如產生菌球的鬚腹菌屬、硬皮馬勃屬、及豆馬勃屬，會產生很多擔孢子，比生菇的外生菌根菌容易收集孢子，且量多。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 3.Many scientists have successfully used basidiospore inoculum of Pisolithus tinctorius to form specific ectomycorrhizae on pine seedlings. 很多科學家已經成功利用彩色豆馬勃的擔孢子接種原，來合成松苗的特別外生菌根。 (1)Spores of Pisolithus tinctorius are collected by crushing sporophores with ruptured peridia over a 25 to 30 mesh screen which allows the mature dry spores to pass through 於25  30網目的篩網上，擠破彩色豆馬勃的外皮，並將孢子果壓碎，以收集擔孢子。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 (2)Screened basidiospores are air-dried for several days at low humidity, then stored at 5℃. Spores collected and stored for several years in this fashion have been used to form Pisolithus ectomycorrhizae on pine. 擔孢子於低濕度下氣乾數天後，貯存於5℃的環境下。 如此收集及保存數年的孢子，曾經被用來培育松樹的 彩色豆馬勃外生菌根。 (3)Some basidiospores of Pisolithus tinctorius will not germinate in the lab, spore viability can only be determined with ectomycorrhizal synthesis tests. 在實驗室中，有些彩色豆馬勃的擔孢子不能發芽。孢 子的活力只能用外生菌根合成試驗來判定。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 (4) A simple, effective inoculation procedure involves dusting dry spores of Pisolithus tinctorius onto soil around young seedlings and leaching them into the root zone with irrigation water. This inoculation has been successful on bare-root and container-grown pine seedlings. 一個簡單且有效的接種方法就是，將彩色豆馬勃的 孢子撒佈於幼苗周圍土壤中，並用灌溉水淋溶至根 域。此一接種技術已經被成功應用於裸根及容器培 育的松苗。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 4. Inoculum composed of spores mixed with a moistened carrier, such as vermiculite, kaolin or sand, can be broadcast onto soil then mixed into the nursery soil or mixed directly into the growing medium of containers to form Pisolithus tinctorius ectomycorrhizae on pine seedlings. 孢子接種原混合濕潤介質，如蛭石、高嶺土或沙，可 以撒至土壤混入苗圃土壤中，或直接混入生長介質 中，以形成松苗的彩色豆馬勃外生菌根。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 5. Some others collect sporephores of Pisolithus tinctorius in the fall and store them at 5℃. In the spring the sporophores with numerous dry spores are broken up into particles 2 to 4 mm in diameter, mixed at undetermined ratios with pine straw or sawdust, and placed as a mulch (護根物) on the seedbeds. However, this method yields highly variable quantities of Pisolithus ectomycorrhizae on seedlings at the end of the season. 也有人在秋天收集彩色豆馬勃的孢子果，並保存於5℃。 在春天，將孢子果打成4至5毫米直徑的顆粒，撒入播種 床。然而，此一方法產生不定數量的外生菌根。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 6. Seed inoculation with basidiospores can be used to form ectomycorrhizae. Sporophores of Rhizopogon luteolus were collected, air-dried and crushed into a fine powder. Seeds of Pinus radiata were mixed with the finely divided sporophores in water. The coated seeds contained approximately 1.9 × 106 spores each. Seedlings which developed from spore-coated seeds formed abundant Rhizopogon ectomycorrhizae in sterile soil and in nonsterile soil that was deficient in ectomycorrhizal fungi. 收集鬚腹菌(Rhizopogon luteolus)的孢子果，將其氣乾並粉碎成細粉。 再將放射松(Pinus radiata)的種子與孢子果的細粉加水混合，則每粒 種子約含1.9 × 106個孢子。由孢子包裹的種子發育成的苗木，形成許 多鬚腹菌外生菌根在無菌土及缺乏外生菌根菌的非無菌土中。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 7. Pine seed encapsulation with 1 mg of spores/seed was effective in forming Pisolithus ectomycorrhizae. 每粒松樹種子包裹1mg孢子，即可有效形成彩色豆馬勃外 生菌根。 8. All basidiospore collections of Pisolithus tinctorius obtained from mature basidiocarps with ruptured peridia contain yeast, bacteria, and an array of other fungi. These microorganisms may cause damage to seeds and seedlings. To decrease this possibility various fungicides were added to encapsulated seeds. Two grams of captan or benomyl (50% WP) or 5.45 grams of thiram (42% EC in latex) were added per 2,000 encapsulated pine seeds.

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 9. In container tests with Pinus taeda, captan and thiram increased and benomyl decreased Pisolithus ectomycorrhizal development on 16-week-old seedlings. Thiram and benomyl also inhibited seed germination.

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 二、菌絲接種原(vegetative inoculum) 1. Pure mycelial or vegetative inoculum of ectomycorrhizal fungi has been repeatedly recommended as the most biologically sound method of inoculation. However, ectomycorrhizal fungi as a group are difficult to grow in the lab. Many species have never been isolated and grown in pure culture. 菌絲接種原培養不易。 2. Isolates of Pisolithus tinctorius from various pines were reported to form abundant ectomycorrhizae on Pinus taeda and Quercus rubra, but isolates from various oak species formed few ectomycorrhizae on pine or oak. 菌絲接種原之宿主專一性。

外生菌根菌接種原的生產: 

外生菌根菌接種原的生產 3. Producing large quantities of vegetative inoculum of a fungus is of little value if the inoculum cannot survive the rigors of various manipulations, such as physical processing (blending, leaching, or drying) and soil manipulation. The inoculum must also be able to survive a minimum of 4 to 6 weeks between soil inoculation and the production of short roots by the seedlings. During this period, it must survive fluctuations of soil moisture, temperature, and microbial competition. 菌絲接種原對水分與溫度之耐性，及微生物競爭的問題。 4. The candidate fungus must be aggressive and can form abundant ectomycorrhizae on seedlings as soon as short roots are produced. 菌絲接種原須有侵略性，而能與苗木之短根迅速形成大量外生菌根。

外生菌根的接種步驟: 

外生菌根的接種步驟 1. 撒佈接種(broadcast inoculations) (1) Spreading a known quantity of mycorrhizal inoculaum over a given area of soil surface and then mixing the inoculum into the soil to a depth of 10 to 20 cm before seeding. 撒佈菌根接種原於土壤表面，並混入10-20 cmg深之土壤中。 (2) Several inocula, including pine duff (半腐植質), sporocarps and spores, and pure culture vegetative mycelium have been applied. 將半腐植質、孢子果、孢子及菌絲混入土壤中。 2. 在種子下方置放帶狀接種原 (1) Inoculum placement below the seed in a layer or band is an effective and efficient inoculation method. 將接種原以帶狀施放於播種條帶之下。 (2) For a 65 ml volume container, banding 10 ml of vegetative inoculum in the center of the container has been adequate for production of mycorrhizal seedlings. 將接種原置於育苗容器之中央。

外生菌根的接種步驟: 

外生菌根的接種步驟 3. 泥滴(slurry dips) (1) Slurries of various forms of mycorrhizal inoculum can be prepared by simply mixing mycorrhizal inoculum with water and, if needed, a carrier such as clay or soil. 將接種原以水或加黏土，或加沙，配成泥漿。 (2) Barerooted or container-grown seedlings are inoculated by dipping them into the slurry before planting. 於栽植前，將裸根苗或容器苗沾泥泥漿。 4. 擔孢子接種(basidiospore inoculation) (1) Suspending spores in water and leaching into nursery soil. 將孢子懸浮於水，澆於土壤中。 (2) Mixing dry spores directly into soil or container medium. 直接將孢子混入土壤或容器介質中。 (3) Coating tree seeds with spores prior to sowing. 播種前將種子裹上孢子。

外生菌根的接種步驟: 

外生菌根的接種步驟 (4) Dusting spores on roots of nonmycorrhizal seedlings. 將孢子噴至苗木根部。 (5) Vermiculite, kaolin, sand, hydromulch, or water may be used as physical carriers of basidiospores for soil infestation. 蛭石、高嶺土、水苔或水可用作擔孢子之載體， 5. 將種子作成小球(pelletizing seed) (1) Seeds can be encapsulated with basidiospores at 1, 2, or 3 mg per seed. 每粒種子包裹1-3 mg 之孢子。 (2) The fungicides captan, and benlate had no effect on development of Pisolithus tinctorius ectomycorrhizae on seedlings when mixed with spore encapsulated seeds prior to sowing. 使用蓋普丹及億力，不影響孢子包裹之種子形成彩色豆馬勃菌根苗。

外生菌根的接種步驟: 

外生菌根的接種步驟 6. 外生菌根苗及根(ectomycorrhizal seedlings and roots) (1) Transplanting mycorrhizal seedlings in nursery beds has been a successful inoculation method where application of soil duff mixtures has not been effective. 移植菌根苗於苗床中。 (2) Mycorrhizal seedlings are planted at 1- to 2-m intervals, and from there mycelia spread to adjacent seedlings. 菌根苗以1-2 m之距離栽植。 (3) At time of lifting, some seedlings are left in beds to serve as inoculum for the next crop. 留少數菌根苗於苗床中，作為接種原。 (4) Roots with abundant mycorrhizae should be selected as inoculum, and should be incorporated while fresh and before sowing seeds. 採用新鮮的菌根，作為接種原。

影響外生菌根接種的因素: 

影響外生菌根接種的因素 1. Length of time fungal isolates have been in culture. 真菌分離株的繼代時間 2. Age of vegetative inoculum. 營養接種原的年齡 3. Inoculation method. 接種方法 **significant interaction between 2 & 3. 4. The host species. 宿主的種類 5. Moisture, mineral nutrients, and pollutants. 水分、礦物質養分、及污染物質 6. Biological factors (interaction with other soil organisms. 生物因子 **A. Most mycorrhizal fungi are adapted to low fertility levels. Current production practices often involve heavy fertilization which may inhibit mycorrhizal development. （大多數菌根菌適應於低肥力環境） **B. Studies have shown that slow release fertilizer (4.5 kg/m3) applied at recommended was not inhibitory to formation of ectomycorrhizae by P. tinctorius. （可使用緩效性肥料）

影響外生菌根接種的因素: 

影響外生菌根接種的因素 ** C. Although light is essential for carbohydrate production and plant carbohydrate levels are known to influence mycorrhizal formation, there is conflicting evidence regarding the light intensity needed for mycorrhizal formation. Mycorrhizal formation increases at both low and high light intensities. These variations may be related to host fungus specificity or to a photoperiodic response. 光度的影響隨宿主與菌類的專一性或對光週期的反應而異 **D. Mycorrhizal formation is influenced by temperature. Most mycorrhizal fungi have an optimum temperature for establishment of the symbiotic relationship and for survival of the mycorrhizal condition. 大多數菌根菌具有最適的生存及發育溫度 **E. Mycorrhizal development in inoculated nursery soils and container growing medium may be suppressed by microorganisms (fungi and plant-parasitic nematodes) present in these substrates. Sterilization of the soil or container medium with fumigants or with low temperature aerated steaming may be used to eliminate feeder root pathogens. Autoclaving and high temperature aerated steaming should be used with caution because of the possibility of toxic formation. 其他微生物及介質均具影響力

外生菌根的定量法: 

外生菌根的定量法 1. Sampling: valid statistical and biological comparisons. 取樣技術 2. Preparing root samples: avoid damages to roots. 製備根部樣本 3. Timing of sampling: from spring to fall. 取樣時間 4. Rooting patterns: upper 15-30 cm of the soil profile or other variations. 根系 5. Contaminating roots: roots of other plants. 污染根群 6. Differing morphological forms: Variations in branching habit of ectomycorrhizae. 不同形態 7. Choosing a quantification method. 選定定量方法

外生菌根的定量法: 

外生菌根的定量法 定量實施方法 1. Sample types: （取樣型式） (1) using root systems for pure culture synthesis of ectomycorrhizae and/or seedling studies. Undercut the nursery beds at a certain depth (10-25 cm) prior to removal by hand. 利用根系供外生菌根純培養合成，或苗木研究。移苗前，底 切苗床10-25 cm深。 (2) using soil cores for large plants in field situations. The diameters of soil cores ranged from 1.2 cm to 10 cm and the depth of sampling ranged from 7.5 cm to 90 cm. The majority sampled to a depth of 30 cm. 利用土球做大樹之調查。土球直徑1.2 –10 cm，深7.5-90 cm。

外生菌根的定量法: 

外生菌根的定量法 定量實施方法 2. Number of samples: optimum number.適宜之樣本數。 3. Preparation of samples: using water to remove soil or potting mixtures from the roots. Vigorous agitation for up to one hour was needed. 以水沖洗，並劇烈震盪 1 hr。

外生菌根的定量法: 

外生菌根的定量法 評估方法 1. 目視估測 (visual estimates): - (absent), + (present), ++ (present in small numbers), +++ (present in large unmbers), and ++++ (mass incidence). Other representation: % of short roots ectomycorrhizal + (< 1%), ++ (< 10%), +++ (< 30%), and ++++ (>30%). Excellent (75-100% short roots ectomycorrhizal), good (50-74% short roots ectomycorrhizal), moderate (24-49% short roots ectomycorrhizal), and poor (1- 24% short roots ectomycorrhizal). a × b/c Where a = % of seedlings with any amount of Pt ectomycorrhizae, b = average % of feeder roots with Pt ectomycorrhizae, and c= average % of total ectomycorrhizae formed by Pt and other fungi.

外生菌根的定量法: 

外生菌根的定量法 評估方法 2.直接計算全根系(Direct counts of entire root system): total number of ectomycorrhizae/seedling, number of ectomycorrhizae/unit length of root or % of short roots ectomycorrhizal. 3.直接計算選擇根(Direct counts of selected roots): number of ectomycorrhizae/unit length of root; or % of short roots ectomycorrhizal. 4. 計算外生菌根的根尖 (Counts of ectomycorrhizal tips): number of living or active ectomycorrhizal tips/unit volume of soil, surface area of ectomycorrhizae/unit volume of soil, number of living ectomycorrhizaltips/soil fraction, or number of living ectomycorrhizal tips/unit weight of soil. For biomass: weight of ectomycorrhizal tips/unit area or weight of ectomycorrhizal tips/unit volume of soil.

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法: 

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法 1. Seedling survival and population density: Population counts or estimates to evaluate survival are most useful at six stages of seedling development: immediately after germination, after one growth season, at the beginning of the second growth season, immediately after transplanting, at the end of one growth season after transplanting, and at the beginning of the second growth season after transplanting. Population changes after one year in seedbed or in containers, or more than one year after transplanting usually continue previous trends.苗木成活率及族群密度。 2. Mass and dimensions: weights and dimensions of roots, stems, and leaves are intercorrelated. In young seedlings, dry weight is the most sensitive indicator. Weigh tops and roots separately because some fungi influence root and top development differentially. Total weights and top:root weight ratios should be recorded. Height (stem length) differences among mycorrhizal treatments are usually the first effects of inoculation visible above the soil line. Stem length = distance from root collar or soil line to base or apex of the apical bud or to the apical node. Stem diameter can be measured at the end of one growth season. Root dimensions are not often recorded.重量及大小。

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法: 

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法 **1. Seedlings one or more years old: Measure fresh or dry weight according to convenience. Dry weight is preferred. Plant height, shoot lengths, and diameter at soil line can serve as bases for calculating volume indices or growth rates. 生理參數 1. Rates of growth or carbon assimilation 生長速率或碳同化作用 2. Rates or products of other physiological processes: transpiration rate, xylem pressure potential.蒸散作用、水分潛勢。 3. Mineral uptake and content: phosphorus, and other element content.礦物吸 收及養分含量。 4. Tolerance of environmental stress: high (40℃) versus moderate (25℃) temperature. Effects of water stress have been evaluated in terms of survival, xylem pressure potential, rates of transpiration and carbon assimilation, leaf conductance, root elongation and increase in root volume during treatment periods.對環境逆壓之抗性。 5. Prevention or mitigation of disease 預防或減輕病害。

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法: 

苗木對接種外生菌根菌反應的評估方法 **菌根對苗木生長及生理的影響 1.苗乾重 ＋ 2.根/莖率 (R/T ratio) － 3.N% (乾重) ＋ 4.苗含氮量(mg/seedling) ＋ 5.P% (乾重) ＋ 6.苗含磷量(mg/seedling) ＋ 7.K% (乾重) ＋ 8.苗含鉀量(mg/seedling) ＋ 9.吸收量(mg/mg dry wt root) N ＋ P ＋ K ＋

埋蠟切片法（Paraffin Method）: 

埋蠟切片法 （Paraffin Method） 一、固定（Fixation） 1. FAA（Formalin Acetic Alcohol）配方： 福馬林5ml，冰醋酸5ml，酒精（95%）50ml，水（DH2O）35ml，混合之。 2. 方法；將洗淨之菌根樣本置入FAA中浸泡1824 h後，再以70%酒精沖洗2次。 二、脫水(Dehydration) 1. 分別配製70%, 85%, 95%, 100%的酒精，及第三丁醇(t-butanol)，作為脫水劑。 2. 脫水步驟如下列： (1) 70% EtOH 8 h (2) 85% EtOH 2 h (3) 95% EtOH 2 h (4) 100% EtOH 2 h (5) t-butanol 2 h (6) t-butanol 8 h

埋蠟切片法（Paraffin Method）: 

埋蠟切片法 （Paraffin Method） 三、滲蠟(Infiltration of Paraffin)：在60℃65℃之溫箱中進行。 1.加入小塊蠟，分五次加入，每次倒去一半溶液，再加入溶化的軟蠟補足。 2.每次2h。 3.最後倒去全部溶液，再加溶化的軟蠟。 4.最後可用硬蠟換2次。 四、埋蠟（Embedding） 1. 將固定瓶中的樣本及蠟倒入模型中，以解剖針挑起樣本，使懸浮於蠟液。 2. 定位樣本，並加標籤。 3. 置入冷水中，使快速凝固。

埋蠟切片法（Paraffin Method）: 

埋蠟切片法 （Paraffin Method） 五、切片（Sectioning） 1.固定於台木。 2.夾於迴轉式切片機（Rotary Microtome）。 3.每秒1－1.5次。切片前後相接成一連續蠟帶。 4.切片厚度約10。 六、張貼切片 1.以膠（蛋白：甘油＝1:1）張貼切片。 七、去蠟：以二甲苯泡5min × 2，無水酒精 5min，95% EtOH 5 min，70% EtOH 5 min，再水洗三次。 八、染色： 1.以1% Safranin O 水溶液6 h，以水沖洗至無色，再以50%及90%丙酮沖洗一次。 2.再以95% EtOH 配製0.5% Fast Green FCF 染色1 min，再以無水丙酮沖洗二次，最後以二甲苯沖洗三次。 九、封片：以二甲苯調松香一滴，蓋上蓋玻片，輕壓即成，也可用無色指甲油封片。

埋蠟切片法（Paraffin Method）: 

埋蠟切片法 （Paraffin Method） 五、切片（Sectioning） 1.固定於台木。 2.夾於迴轉式切片機（Rotary Microtome）。 3.每秒1－1.5次。切片前後相接成一連續蠟帶。 4.切片厚度約10。 六、張貼切片 1.以膠（蛋白：甘油＝1:1）張貼切片。 七、去蠟：以二甲苯泡5min × 2，無水酒精 5min，95% EtOH 5 min，70% EtOH 5 min，再水洗三次。 八、染色： 1.以1% Safranin O 水溶液6 h，以水沖洗至無色，再以50%及90%丙酮沖洗一次。 2.再以95% EtOH 配製0.5% Fast Green FCF 染色1 min，再以無水丙酮沖洗二次，最後以二甲苯沖洗三次。 九、封片：以二甲苯調松香一滴，蓋上蓋玻片，輕壓即成，也可用無色指甲油封片。

林木固氮作用Forest Tree Nitrogen Fixation: 

林木固氮作用 Forest Tree Nitrogen Fixation Actinorhiza (放線菌根) Frankia Rhizobium (根瘤菌) Isolation of Rhizobium (根瘤菌的分離) Sampling (取樣) Cleaning (清洗 ) Sterilization (消毒) Plating (isolation) (分離) Culturing & Propagation (培養及繁殖)

林木固氮作用Forest Tree Nitrogen Fixation: 

林木固氮作用 Forest Tree Nitrogen Fixation Isolation of Frankia Sampling Cleaning Sterilization Isolation Culturing & Propagation

林木固氮作用與森林生態系氮素的平衡作用Nitrogen Fixation and Forest Ecosystem: 

林木固氮作用與森林生態系氮素的平衡作用 Nitrogen Fixation and Forest Ecosystem 自然界中氮的循環 1.氮的固定 (1) 電化學或光化學：Lightening (2) Synthetic nitrogen fertilizer (3) Biological nitrogen fixation Symbiotic nitrogen fixation A. Actinomycetea and leguminous plants：10 sp. vs. 24 sp. B. Rhizobia and non-leguminous plants：4 gen. C. Rhizobia and leguminous plants：11 sp. vs. 45 sp.

林木固氮作用與森林生態系氮素的平衡作用Nitrogen Fixation and Forest Ecosystem: 

林木固氮作用與森林生態系氮素的平衡作用 Nitrogen Fixation and Forest Ecosystem Non-symbiotic nitrogen fixation A. Anaerobic nitrogen fixer B. Aerobic nitrogen fixer C. Blue-green algae 二、氮的氨化作用(ammonification) 三、硝化作用(nitrification) 四、脫氮作用(denitrification) NO3 → NO2 → NO → N2O → N2

磷的循環: 

磷的循環 Phosphorous movement 無機磷(可溶性)正磷酸鹽 PO4-3 可溶性有機磷 粒狀有機磷(不溶 性)(活或死的原生質體) 分解或排泄

生物肥料菌劑的生產與應用: 

生物肥料菌劑的生產與應用 生物肥料菌劑的量產有下列方法 1.菌根菌的固體培養(消毒) 蛭石：泥炭土：苔蘚=1:1:1 加MMN液態培養基 草炭150g，細沙(或蛭石粉)50g，玉米粉9g，蔗糖1g，麥芽汁300mL 2.菌根菌的液體培養(消毒) (1) 甘藍或馬鈴薯100g，用1L水煮後過濾之濾液，加0.3% glucose及微量維他命B1，經高溫滅菌後備用 。

生物肥料菌劑的生產與應用: 

生物肥料菌劑的生產與應用 2.菌根菌的液體培養(消毒) (1) 甘藍或馬鈴薯100g，用1L水煮後過濾之濾液，加0.3% glucose及微量維他命B1，經高溫滅菌後備用 。 (2) MMN培養液 3.菌根菌的發酵培養(消毒) (1)震盪發酵培養 (2)發酵槽培養

菌劑類型與生產: 

菌劑類型與生產 1.液體菌劑 2.固體菌劑：菌種加固體原料、及填充料 3.粉劑：孢子加蛭石粉 4.顆粒劑：孢子加填充料 5.丸劑：包海藻酸鹽使成膠囊。

菌根技術的應用: 

菌根技術的應用 1.引種 2.育苗 3.逆境造林 4.經濟樹木造林 5.防治根部病害 6.食用菌根菌

菌根應用注意事項: 

菌根應用注意事項 1.適地適菌 2.林業技術的配合 3.正確的接種技術

食用菌根菌的栽培方法 : 

食用菌根菌的栽培方法 一、客土接種法：利用有菌根菌的林地土壤(運送費工、雜菌)。目前少用。 二、孢子液或菌絲體接種法：可用於小苗。不宜用於林地（需大量菌種、自然條件不利菌種的存活與生長）。效果不佳。 三、菌根合成(mycorrhizal synthesis)：將菌根菌的純菌種，以人工接種技術使林木的根部形成菌根。這是栽培食用菌根菌的必經之路，也是最有可能成功的方法。 四、Delmas (1978) 提出菌根菌的合成路徑圖。

食用菌根菌的栽培方法(續) : 

食用菌根菌的栽培方法(續) 孢子或菌絲碎片 自然生態 寄主林木 無菌培養基 純培養 菌根合成 培養基改良 菌絲體 子實體分化 子實體分化 子實體 菌絲改良 哉培技術 圖8 菌根菌的培養方法 經濟評估

菌根菌的合成方法: 

菌根菌的合成方法 自然 寄主苗木 菌根菌子實體 實生苗、扦插苗、組培苗 菌根菌純培養 菌種大量培養 無菌培養基質 人工接種

菌根菌的合成方法(續): 

菌根菌的合成方法(續) 人工接種 菌根化苗 苗木撫育 子實體分化 合適的環境 子實體

松茸(松口蘑)的合成技術: 

松茸(松口蘑)的合成技術 1.松茸可與多種松樹、鐵杉、及冷杉共生，如赤松(Pinus densiflora)、雲南松(P. yunnanensis)、黑松(P. thunbergii) 、華山松(P. armandii)、台灣二葉松(P. taiwanensis)、高山松(P. densata)、紅松(P. koraiensis)、馬尾松(P. massoniana)、日本鐵杉(Tsuga divertsifolia)、及大白葉冷杉(Abies mariesii)等。 2.松茸的營養需求特性： (1)PDMA (Potato dextrose malt extract agar) (2)MMN (3)MMN (無氮) ＋ 谷氨酸鈉 (sodium glutamic acid)

松茸(松口蘑)的合成技術(續): 

松茸(松口蘑)的合成技術(續) 1. 松茸的分離較一般真菌的分離困難。 2. 松茸的菌絲體可利用葡萄糖、果糖、甘露糖、及麥芽糖。 3. 松樹的根皮層內含葡萄糖及果糖(1:1)。 4. 維生素：nicotinic acid, vitamin B1, vitamin B2, folic acid, biotin. 5. 松茸的菌絲體在8℃開始生長，最適溫度為20  24℃，到32℃停止生長。當菌絲體達生理成熟期時，地表5  10 cm 之溫度降至19℃，且維持4  5 天之久時，松茸的子實體原基就會進行分化。若土溫繼續維持在20℃以下達15  20 天，則松茸的子實體即可大量發生。所以適當的低溫是松茸的子實體形成的重要因素。

松茸(松口蘑)的合成技術(續): 

松茸(松口蘑)的合成技術(續) 6. 適宜的土壤含水量對松茸菌絲體的生長有利。松茸出菇時的空氣濕度以85%為宜。如出菇前半個月前，遇到小雨，不僅提供子實體發育的水分，也可降低土溫，有利於子實體的形成。 7. 各地的松茸生物特性不同，應以當地種原栽培為佳。 8. 目前，松茸的人工栽培僅是在原有松林的基礎上，增加人工的處理，以提高松茸的產量，並非真正的菌根合成。 9. 日本學者小川真(1980)指出，松茸菇圈的大小，主要受(1)林地中松樹幼根，(2)土壤中雜菌或拮抗菌，數量的影響。在日本能滿足此一條件的是，20  40 年生的赤松林，土壤瘠薄，通氣良好，地勢高燥，排水良好，松櫟混合林，鬱閉度60%，下層植被稀疏者。

食用菌根菌之經營模式: 

食用菌根菌之經營模式 一、人工促進天然食用菌根菌之增產模式 需要較多的林木營養根。 土壤中之雜菌及拮抗菌較少。 改善食用菌根菌之生態條件。 保持森林的結構及植被條件，雜草及灌叢不利子實體產生，枝葉以2-3 cm為宜。 土壤以貧瘠者較有利於食用菌根菌之生長與發育。

食用菌根菌之經營模式(續): 

食用菌根菌之經營模式(續) 不可使用化學農藥。 不可施用大量的氮肥及磷肥。 林地含菌量可採用天然孢子或人工培養的菌絲體，進行人工接種。可翻鬆地表0-15 cm，再灑入孢子或菌絲體，使與營養根接觸，再覆土。不宜在雨季，可選手秋季進行之。也可採用客土法。 可利用塑膠材料搭建棚架，以調控溫度及濕度，提早採收期並促進產菇量。

食用菌根菌之經營模式: 

食用菌根菌之經營模式 二、半人工合成食用菌根菌之生產模式 生產菌根化苗木 人工接種生產高品質無雜菌之菌根化苗木 假植苗木於產菇林地，以達到苗木之天然接種 選擇適宜地點營造食用菌根菌林分 補植苗木，調整林分的鬱閉度 選擇適宜的生育地進行造林，初期可植10,000株/ha， 出菇期則疏伐至1,500-3,000株/ha。 出菇期應注意管理水分、溫度、濕度、光度等因素。

食用菌根菌森林之經營模式: 

食用菌根菌森林之經營模式 樹木無菌幼苗 樹木幼苗 菌根菌人工 無菌介質 林地自然接種 接種 適宜的環境 菌根化苗木

食用菌根菌森林之經營模式(續): 

食用菌根菌森林之經營模式(續) 菌根化苗木 林地選擇 食用菌根菌林 適宜的條件及密度 及林地清理 之營造 食用菌根菌林 之經營與管理 食用菌根菌產品

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions: 

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions 1. Alkalinity: Janardhan (1994) indicated that Vam colonization was observed in all six plant species and the maximum colonization was in introduced bamboos (81.2%). Rhizosphere soil of the plants harboured a significant population of VAM fungi belonging to the genera, Glomus, Acaulospora and Entrophospora. VAM fungi are that most commom of all the mycorhizae and are widely recognized as components of all terrestrial ecosystems.

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions: 

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions 2. Salinity: Mycorrhization did not occur in plants where soil sal concentration exceeded 3.3 mg/g. A wide ranging survey of saline soils in California and Nevada found mycorrhizal plant roots and VA mycorrhizal fungi in a range of 185 dsm-1 (Pond et al., 1984). Soil salinity may affect the growth and activity of VAM fungi. Germination of spores of a VAM fungus can be described as consisting of various phases: hydration, germ tube emergence and growth of hyphae (Tommerup, 1984)

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions: 

The Growth of VAM Fungi under Stress Conditions 3. Arid and semi arid soils: It is evident that AM fungi have a greater exploring ability that the root and overcome limitations on the acquisition of ions that diffuse to the root environments and move slowly in the soil solution of the rhizosphere. 4. pH: 5.5 and Al, Mn

根圈復健之生態學(Ecology of Rhizosphere Bioremediation): 

根圈復健之生態學(Ecology of Rhizosphere Bioremediation) Biodegradation: 生物降解作用 Bioremediation: 生物復健，利用生物降解作用來減低污染物之濃度及毒性。 Dissipate: 消散，污染物的濃度因生物及非生物的影響而減低。 Metabolism:代謝作用，生物藉一整套的酵素反應，將養分轉變成能量及生物量。

根圈復健之生態學(Ecology of Rhizosphere Bioremediation): 

根圈復健之生態學(Ecology of Rhizosphere Bioremediation) Rhizodegradation: 根圈降解。經由根與細菌及真菌之作用，以加速難分解有機污染物之生物降解。 Rhizodeposition: 根圈堆積。植物根部釋出含碳化合物至根圈。 Rhizosphere: 植物根部所直接影響的土壤區域。 Rhizosphere effect: 根圈較高微生物生物量及活性。

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) Mycorrhizosphere:真菌根圈 。根圈微生物相(microflora)與囊叢枝菌根菌的交感作用。 交感作用的類型： 1.Positive/Synergistic VAM支持許多bacteria的生長:symbiotic bacteria free-living di-nitrogen fixer, plant-growth-promoting bacteria, and phosphorus-solubilizing bacteria. Also, VAM fungal spores may germinate better, and its hyphae may grow better.

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) 交感作用的類型： Actinomycetes Glomus fasciculatum Frankia G. fasciculatum Streptomyces cinnamomeous Symbiotic bacteria Glomus mosseae Rhizobium leguminosarum G. Versiforme R. loli

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) 交感作用的類型： Free living nitrogen fixer Glomus fasciculatum Beijerinckia mobilis G. fasciculatum Azotobacter chroococcum G. fasciculatum, G. margarita Azospirillum brasilense Plant growth promoting bacteria Glomus versiforme Pseudomonaus sp.

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) 交感作用的類型： Phosphate solubilizing bacteria Endogone sp. Agrobacterium sp. Pseudomonaus sp. G. macrocarpum Bacillus megaterium Pseudomonaus fluorescence

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) 交感作用的類型： Fungi Glomus macrocarpum Cladosporum sp. Gliocladium virens G. intraradices Fusarium oxysporum f. sp. chrysanthemi 2. Negative/Antagonistic

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) 交感作用的類型： 2. Negative/Antagonistic Fungi Glomus mosseae Phytophthora nicotianae var. parasitica Glomus sp. Rhizoctonia solani G. fasciculatum Phytophthora parasitica Bacteria G. mosseae Azotobacter chrococcum

真菌根圈 (Mycorrhizosphere): 

真菌根圈 (Mycorrhizosphere) Mycoparasitism (真菌寄生 )of VAM fungi Mycoparasites include Fusarium sp., Humicola sp. (腐質霉), Verticillum spp. (輪枝孢), Trichoderma spp., Penicillium spp. (青霉菌), Phlyctochytrium sp. (囊壺菌), Stachybotyris spp. (葡萄穗孢) 。

真菌生與非真菌生植物 (Mycotrophic versus nonmycotrophic plants): 

真菌生與非真菌生植物 (Mycotrophic versus nonmycotrophic plants) 植物移動及吸收磷鹽(Pi)有賴植物、真菌及細菌覓食Pi。 一般真菌生植物的細胞間Pi濃度比土壤中者高1000倍，表示耗費高能量於磷鹽的吸收。 非真菌生植物演化成更有效順化於缺磷的環境。