ELISA 2004

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Emil Von Behring 1854-1917 Nobel de Medicina 1901 1890 “Soroterapia da difteria” Frascos originais Soro anti toxina diftérica -1896 Shibasaburo Kitasato 1852-1931 Toxina diftérica A descoberta dos anticorpos Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia 1901 Inst. Butantan 1892 Inst. Pasteur A descoberta dos anticorpos “Soroterapia do ofidismo” Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Friedrich Wernicke Emil Von Behring 1898 Imunização com Toxina Neutralizada A descoberta dos anticorpos Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Gaston Ramon 1886-1963 1922 Ação Formol e Calor Toxinas Diftérica e Tetânica Anatoxinas A descoberta dos anticorpos Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Arne Tiselius 1902-1971 Nobel Química 1948 1939 Síntese e estrutura dos anticorpos Natureza gama-globulínica dos anticorpos Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Cesar Milstein 1927-2002 Georges Khöler 1946-1995 Nobel Medicina 1984 1975 Síntese e estrutura dos anticorpos Anticorpos Monoclonais Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia 1985 Síntese e estrutura dos anticorpos Base genética da diversidade anticórpica Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Lisozima Determinante Antigênico Resíduo Gln121 H2O Determinante Antigênico Fab Ag Síntese e estrutura dos anticorpos  Forças iônicas pontes H+ Van der Waals hidrofóbicas Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Emil Von Behring 1854-1917 Nobel de Medicina 1901 Shibasaburo Kitasato 1852-1931 Neutralização 1890 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Richard Pfeiffer 1858-1945 1894 Bacteriólise vibrião colérico Peritônio cobaias imunes Hans Buchner 1850-1902 1889 Poder Bactericida Soro Alexina Jules Bordet 1870-1961 Nobel de Medicina 1918 1895 Fenômeno de Pfeiffer in vitro Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes “COMPLEMENTO” Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Georges Fernand Isidore Widal 1862-1929 Max Von Gruber 1853-1927 Aglutinação 1897 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Rudolf Kraus 1868-1932 Precipitação 1897 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Jules Bordet 1870-1961 Nobel de Medicina 1918 1906 Reação Fixação Complemento Diagnóstico Sífilis Reação de Fixação do Complemento 1901 August Von Wasserman 1866-1925 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Opsonização 1903 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Precipitação Quantitativa 1935 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Ruptura do Conceito de Atividade Específica dos Anticorpos: antitoxinas aglutininas precipitinas opsoninas Surgimento da Teoria Unitária Posteriormente também refutada 1935 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Imunofluorescência 1942 Marcação de Acs Fluorocromos Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Jacques Oudin 1908-1985 Örjan Ouchterlony Suécia Stephen D. Elek Inglaterra 1946 Imunodifusão Simples Em gel de ágar 1948 Imunodifusão Dupla Radial Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Rosalyn Yalow 1921- Nobel Medicina 1977 Radioimunoensaio 1959 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Stratis Avrameas-França Imunoperoxidase 1966 Paul Nakane-EUA Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Eva Engvall Peter Perlmann ELISA 1971 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia WESTERN BLOTTING 1979 Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Harry Towbin et al. Basiléia-Suiça Leonardo J. Richtzenhain

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Uma retrospectiva da evolução da Sorologia Neutralização Aglutinação Precipitação Fixação do Compl. 1 8 9 0 1 8 9 7 1 9 0 1 Imunofluorescência 1 9 4 2 1 9 5 9 Radioimunoensaio 1 9 6 6 Imunoperoxidase 1 9 7 1 ELISA 1 9 7 9 Western Blotting Testes Ligação Primária * Atividade anticorpos & Desenvolvimento Testes Leonardo J. Richtzenhain

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Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay Prof.Dr. Leonardo J. Richtzenhain VPS/FMVZ/USP ELISA

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Marcação de Anticorpos 1966 Nakane Avrameas Conjugação de anticorpos com a Peroxidase Inicialmente aplicada a antígenos figurados IPO IF Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

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EIE Todo em fase líquida HOMOGÊNEOS HETEROGÊNEOS Separação em fase sólida (ELISA) CROMÓGENOS SOLÚVEIS CROMÓGENOS INSOLÚVEIS (IPO / W. BLOTTING) Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

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EIE Todo em fase líquida HOMOGÊNEOS LIGAÇÃO AgXAc ALTERA ATIVIDADE DA ENZIMA TUDO MEDIDO EM FASE LÍQUIDA SEM SEPARAÇÃO DO REAGIU EM FASE SÓLIDA Ensaios Imunoenzimáticos (EIE) EXEMPLO : Dosagem de THC (tetrahidrocarbinol)

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1971 Engval & Perlmann IMOBILIZAÇÃO DE ANTÍGENOS SOLÚVEIS EM FASES SÓLIDAS (PLÁSTICOS) ELISA Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

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ELISA FASE SÓLIDA POLIESTIRENO POLIVINILCLORETO NYLON IMUNOPEROXIDASE SOBRE TECIDOS OU CULTURAS CELULARES WESTERN BLOTTING SOBRE PAPEL DE NITROCELULOSE OU NYLON APÓS TRANSFERÊNCIA DO GEL DE ELETROFORESE UTILIZAM UMA ENZIMA PARA GERAR O SINAL DA REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO Ensaios Imunoenzimáticos (EIE)

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O QUE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ??? Pureza Atividade específica Limiar de detecção Facilidade de conjugação Eficácia após conjugação Estabilidade do conjugado Ensaios Imunoenzimáticos (EIE) ENZIMAS

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PEROXIDASE FÁCIL OBTENÇÃO E BAIXO CUSTO ALTA TAXA DE “TURNOVER” FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO VÁRIOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS

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PEROXIDASE Como se processa a reaçaõ ???? H2O2 Cromógeno COR

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CROMÓGENOS PARA PEROXIDASE Orthophenylene diamine (OPD) 5-aminosalicylic acid (5AS) Tetramethylbenzidine (TMB) 2,2 azino-di(3- ethylbenzothiazoline) (ABTS) 4-Cloronaphthol Diaminobenzidine (DAB)

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Fosfatase alcalina USO DE FLUOROGÊNICOS ALTO CUSTO BAIXA TAXA DE “TURNOVER” FÁCIL CONJUGAÇÃO A PROTEÍNAS POUCO ESTÁVEL APÓS CONJUGAÇÃO POUCOS CROMÓGENOS DISPONÍVEIS MELHOR SINAL NO “WESTERN BLOTTING” (???)

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Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA DIRETO (Titulação de conjugado) DIRETO COM Ac CAPTURA (ANTÍGENO) INDIRETO (ANTICORPOS) INDIRETO COM Ac DE CAPTURA (ANTÍGENO E ANTICORPOS) BLOQUEIO EM FASE LÍQUIDA (ANTICORPOS) COMPETITIVOS (ANTICORPOS) ELISPOT (CÉLULAS SECRETORAS DE Ac)

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AMPLIFICAÇÃO DE SINAIS USO DE BIOTINA - AVIDINA + = Ac Biotina + = Avidina Peroxid. USO DE SUBSTRATO FLUOROGÊNICO

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Lavagens Lavagens Lavagens

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ELISA INDIRETO Lavagens Lavagens Lavagens Lavagens

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ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA Sanduíche simples Lavagens Lavagens Lavagens Lavagens

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ELISA INDIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA Sanduíche duplo Lavagens Lavagens Lavagens Lavagens Lavagens