Next Generation Sequencing by Dr Arianna Nicolussi

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By: Cattapan (70 month(s) ago)

Una presentazione molto puntuale e utile. E' possibile averne una copia?(federica.cattapan@gmail.com)

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Next-generation DNA sequencing

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Deoxyribonucleic acid (DNA) 1869 (Miescher) Scoperta del DNA 1944 (Avery–MacLeod–McCarty) Avery ei suoi colleghi suggeriscono che il DNA, piuttosto che proteico, come ampiamente creduto all ’ epoca, possa essere il materiale ereditario dei batteri, probabilmente analogo ai geni e/o virus in organismi superiori 1953 ( James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins, and Rosalind Franklin) La struttura del DNA La replicazione del DNA è basata sulla complementarietà tra basi azotate 1970 In rapida successione sono ideati differenti metodi di sequenziamento del DNA. Sanger e i colleghi dell ’ Università di Cambridge creano il metodo “ a terminazione di catena “ (Sanger, 1977) che utilizza dideossinucleotidi trifosfati (ddNTP) per arrestare la sintesi del DNA in posizione 3' al posto dei normali deossinucleotidi trifosfati (dNTP). Il metodo di Sanger spiazza rapidamente quello di Maxam e Gilbert ( ‘ 76-77), basato sulla modificazione chimica del DNA e il suo clivaggio in corrispondenza di specifiche basi http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_orbit_animated.gif

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Perché sequenziare? MEDICINA SCIENZE FORENSI BIOLOGIA AGRICOLTURA

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L’avanzamento tecnologico 1977 Metodo di Sanger 1977 Metodo di Maxam e Gilbert 1986-87 La CalTech presenta il primo sequenziatore semiautomatico 1994 Microarrays per l ’ espressione genica e le analisi di sequenza 1998 Identificazione della specifica funzione di un gene mediante screening con RNAi Genotipizzazione degli SNPs mediante spettrometria di massa 2005 Next Generation Sequencing (NGS): sequenziamento massivo parallelo mediante sintesi di “ Pol imerase col ony ” (Polony) dell ’ intero genoma. Il metodo “ Polony ” viene sviluppato nei laboratori di George M. Church ad Harvard ed è tra i primi sistemi NGS. Le “ polonies ” sono colonie di ampliconi di PCR ottenute a partire da una singola molecola di acido nucleico. 2008 Sequenziamento di singole molecole di DNA 2010 Sequenziamento di singole molecole di DNA in tempo reale Metodi di sequenziamento di prima generazione “ Shotgun sequence ” basato sulla metodica di Sanger ..prevede… frammentazione del DNA clonaggio in vettori plasmidici reazioni di sequenziamento cicliche separazione mediante elettroforesi lettura della sequenza attraverso “ tag ” fluorescenti 2011 Il sequenziatore Ion PGM è il primo a decodificare il genoma del batterio E. coli in occasione dell'epidemia che ha colpito la Germania nel 2011.

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Cos’è la Next Generation Sequencing (NGS)? Tutte le piattaforme NGS disponibili presentano una caratteristica tecnologica comune: il sequenziamento parallelo massivo di molecole di DNA amplificate in modo clonale o di singole molecole di DNA separate spazialmente in una cella a flusso ( “ flow cell ” ). Questa strategia rappresenta un cambiamento radicale rispetto al metodo di sequenziamento descritto da Sanger, che si basa sulla separazione elettroforetica di frammenti di lunghezza diversa ottenuti mediante singole reazioni di sequenziamento. 454 Sequencing / Roche GS junior System GS FLX + System Illumina ( Solexa ) HiSeq System Genome analyzer IIx MySeq Applied Biosystems - Life Technologies SOLID 5500 System SOLID 5500xl System Ion Torrent - Life Technologies Personal Genome Machine (PGM) Proton Helicos Helicos Genetic Analysis System Pacific Biosciences PacBio RS Oxford nanopore Technologies GridION System MinION Nelle tecnologie NGS, invece, il sequenziamento viene effettuato mediante cicli ripetuti di estensioni nucleotidiche ad opera di una DNA-polimerasi o, in alternativa, mediante cicli iterativi di ligazione di oligonucleotidi. Poiche la procedura è parallela e massiva, tali piattaforme consentono di sequenziare da centinaia di Mb (milioni di paia di basi) fino a Gb (miliardi di paia di basi) di DNA in un ’ unica seduta analitica, a seconda del tipo di tecnologia NGS utilizzata. Next Generation Sequencing - NGS Sequenziamento di singole molecole di DNA amplificate Sequenziamento di terza generazione Next Next generation Sequencing Sequenziamento di singole molecole di DNA

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“workflow” PCR “ Polony ” su slide Emulsion PCR Pirosequenziamento (454) “ Semiconductor sequencing ” (Ion Torrent) Sequenziamento mediante ligazione (SOLID) Sequenziamento mediante terminazione reversibile (Illumina) Preparazione della libreria

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“emulsion PCR”

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Piattaforme Next Generation Sequencing

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La tecnologia Roche/454 FLX (http://www.454.com/enablingtechnology/the-system.asp) deriva dalla convergenza di due metodiche: il pirosequenziamento e la “ polymerase chain reaction ” (PCR) in emulsione. 2000  Jonathan Rothberg fonda la societa 454 Life Sciences , che ha portato allo sviluppo della prima piattaforma NGS disponibile commercialmente (GS 20), commercializzata nel 2005. Grazie alla combinazione tra PCR di singole molecole in emulsione e pirosequenziamento, Margulies et al. alla 454 Life Sciences hanno effettuato il sequenziamento dopo frammentazione casuale ( “ shotgun sequencing ” ) dell ’ intero genoma di Mycoplasma genitalia (580.069 paia di basi) in un ’ unica seduta analitica, utilizzando la piattaforma GS 20 e ottenendo una copertura o livello di ridondanza ( “ coverage ” ) del 96% e un ’ accuratezza del 99,96% . 2007  454 Life Sciences è acquisita da Roche Applied Science, che introduce una seconda versione della piattaforma 454, la GS FLX, che si basa sulla stessa tecnologia di GS 20, ma prevede l ’ impiego di una “ slide ” a fibre ottiche definita piastra “ picotiter ” , sulla cui superficie sono incisi circa 3,4 x 10 6 pozzetti in ciascuno dei quali avviene la reazione di sequenziamento (con volume nell ’ ordine dei picolitri), le cui pareti presentano un rivestimento in metallo per aumentare la discriminazione tra segnale e rumore di fondo. Roche/454 FLX ..descritto da Nyren et al. nel 1993, è basato sulla rilevazione della chemiluminescenza derivante dal rilascio del pirofosfato a seguito dell ’ incorporazione di deossinucleosidi trifosfato (dNTP) ad opera di una DNA-polimerasi. ..descritta da Griffiths e consistente nell ’ amplificazione di singole molecole di DNA in micro-compartimenti, costituiti da emulsioni di acqua-olio.

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Per il sequenziamento viene generata una libreria di frammenti di DNA-stampo mediante nebulizzazione o sonicazione . 1 Successivamente alle estremità di tali frammenti di DNA a doppio filamento (lunghi diverse centinaia di basi) vengono legati degli oligonucleotidi adattatori. 2 La libreria viene quindi diluita a una concentrazione tale da ottenere singole molecole di DNA, che sono denaturate e ibridate a singole biglie rivestite da sequenze complementari a quelle degli oligonucleotidi adattatori. Le biglie sono catturate nelle goccioline di un ’ emulsione acqua-olio, in cui avviene la reazione di amplificazione clonale (mediante PCR in emulsione) di ogni singola molecola di DNA legata a ciascuna biglia. 3 Adattato da Metzker, 2010 Dopo l ’ amplificazione, le biglie che portano immobilizzati i prodotti di amplificazione clonale vengono recuperate dall ’ emulsione, separate mediante un ’ ulteriore diluizione, depositate nei singoli pozzeti di una piastra “ picotiter ” e combinate con gli enzimi necessari per la reazione di sequenziamento. 4 Adattato da Metzker, 2010 “workflow”  Preparazione della libreria  emulsion PCR  pirosequenziamento

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La piastra viene introdotta nel sequenziatore GS FLX e funge da cella a flusso, in cui sono effettuati cicli iterativi di pirosequenziamento mediante aggiunte successive di dNTP. All ’ interno di ogni pozzetto contenente i prodotti di amplificazione clonale, ad ogni incorporazione nucleotidica si ha la produzione di pirofosfato e la conseguente generazione di un segnale luminescente, che viene trasmesso attraverso le fibre ottiche della piastra e registrato da una camera “ charge-coupled device ” (CCD). Dopo l ’ aggiunta di ciascun dNTP, il segnale luminoso derivante da ciascun pozzetto viene acquisito, analizzato per valutare il rapporto tra segnale e rumore di fondo, filtrato in base a criteri di qualità e successivamente tradotto mediante algoritmi in una sequenza lineare. 5  la lunghezza delle “ reads ” , che facilita l ’ assemblaggio de novo ( “ denovo assembly ” ) di interi genomi .  l ’ accuratezza della determinazione di omopolimeri di lunghezza >3-4 bp. Un omopolimero di 6 basi dovrebbe teoricamente generare un segnale di luminescenza pari al doppio del segnale generato da un omopolimero di 3 basi. Operativamente, si ottiene un segnale di luminescenza variabile e, all ’ aumentare della lunghezza dell ’ omopolimero, le stime della sua lunghezza diventano meno accurate. Il rivestimento in metallo delle pareti dei pozzetti della piastra “ picotiter ” dovrebbe migliorare l ’ accuratezza nella determinazione della lunghezza dell ’ omopolimero. Punto di forza della tecnologia Roche/454 FLX …uno dei problemi maggiori…

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Illumina/Solexa 1997  Balasubramanian e Klenerman ideano un approccio per il sequenziamento di singole molecole di DNA legate a microsfere e l ’ anno successivo fondano Solexa . ..dal 2006  la prima piattaforma per il sequenziamento di frammenti corti ( “ short reads ” ) di DNA (Solexa Genome Analyzer) è introdotta sul mercato e, in seguito, acquisita da Illumina (http://www.Illumina.com). Lo strumento utilizza una cella a flusso consistente in una “ slide ” otticamente trasparente costituita, sulla superficie, da 8 comparti a cui sono legati degli oligonucleotidi di ancoraggio. Il DNA stampo è frammentato in segmenti lunghi alcune centinaia di basi e modificato per generare estremità tronche 5 ’ -fosforilate. Una singola base di adenina viene aggiunta all ’ estremità 3 ’ del frammento di DNA stampo fosforilato, in modo che sia facilitata la reazione di ligazione agli oligonucleotidi adattatori che presentano al 3 ’ una sporgenza di una singola base di timina. Gli oligonucleotidi adattatori sono complementari agli oligonucleotidi ancorati alla cella a flusso.

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In condizioni di diluizione limite, il DNA stampo a singolo filamento legato agli adattatori è aggiunto alla cella a flusso e immobilizzato mediante ibridazione agli oligonucleotidi di ancoraggio. A differenza della PCR in emulsione, i frammenti di DNA sono amplificati nella cella a flusso mediante una amplificazione “ a ponte ” ( “ bridge amplification ” ), che si basa sulla cattura dei filamenti di DNA ripiegati ad arco che si ibridano a un oligonucleotide di ancoraggio adiacente. Cicli multipli di amplificazione convertono la singola molecola di DNA stampo in un “ cluster ” di frammenti ripiegati, amplificati clonalmente, ciascuno composto approssimativamente da 1000 ampliconi clonali. Adattato da Metzker, 2010 “workflow”  Preparazione della libreria  amplificazione a ponte  sequenziamento mediante reazioni reversibili di terminazione

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Per il sequenziamento, i “ cluster ” sono denaturati e una successiva reazione di scissione chimica e lavaggio consente di ottenere solo i filamenti “ senso ” ( “ forward ” ). Il sequenziamento dei filamenti “ senso ” avviene mediante l ’ ibridazione di un “ primer ” complementare alla sequenza dell ’ oligonucleotide adattatore; successivamente, si ha l ’ aggiunta di una DNA polimerasi e di una miscela di 4 nucleotidi terminatori “ reversibili ” marcati con fluorofori differenti . I nucleotidi terminatori sono incorporati in base alla complementarietà della sequenza di ciascun filamento, all ’ interno di ogni “ cluster ” clonale. Dopo l ’ incorporazione, i reagenti in eccesso vengono rimossi con un lavaggio e la fluorescenza relativa ad ogni “ cluster ” viene rilevata e registrata. Mediante successivi passaggi, il gruppo di blocco dei nucleotidi terminatori “ reversibili ” viene rimosso e la marcatura fluorescente viene allontanata tramite un lavaggio, consentendo di effettuare il ciclo successivo di sequenziamento. Questo processo iterativo di “sequenziamento per sintesi” richiede circa 2,5 giorni per generare “reads” di 36 bp di lunghezza.

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…uno dei problemi maggiori… Con la piattaforma Illumina l ’ accuratezza nell ’ identificazione delle basi ( “ base calling ” ) diminuisce con l ’ aumentare della lunghezza della “ read ” . Questo fenomeno e dovuto principalmente all ’ aumento di segnali di interferenza ( “ dephasing noise ” ). “ dephasing noise ” i nucleotidi possono essere incorporati in eccesso o in difetto; la rimozione del blocco puo fallire …con i cicli successivi, questi segnali di errore si accumulano producendo una popolazione eterogenea di filamenti di varia lunghezza all ’ interno di un “ cluster ” . Questa eterogeneita riduce la specificità del segnale e la precisione nel “ base calling ” , specialmente all ’ estremita 3 ’ delle “ reads ” . Attualmente, si stanno sviluppando modificazioni nella chimica di sequenziamento e negli algoritmi per l ’ analisi e l ’ interpretazione dei dati per attenuare questo fenomeno di “ dephasing ” .

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Applied Biosystems La piattaforma “ Supported Oligonucleotide Ligation and Detection ” (SOLiD) System 2.0, distribuita da Applied Biosystems (http://www.solid.appliedbiosystems.com), è una tecnologia per il sequenziamento di “ short reads ” di DNA basata su reazioni di ligazione. Questo approccio è stato sviluppato nel laboratorio di George Church e applicato nel 2005 al risequenziamento del genoma di Escherichia coli. 2007  Applied Biosystems ha migliorato tale tecnologia consentendo la distribuzione della strumentazione SOLiD . La preparazione dei campioni è simile quella effettuata per la tecnologia 454, in cui i frammenti di DNA sono legati a oligonucleotidi adattatori, immobilizzati su biglie e amplificati clonalmente mediante PCR in emulsione. Le biglie recanti i prodotti di amplificazione clonale vengono fissate sulla superficie di vetro funzionalizzata di una cella a flusso, sulla quale ha luogo la reazione di sequenziamento che viene innescata tramite l ’ ibridazione di un “ primer ” complementare all ’ adattatore a livello della giunzione adattatore-DNA stampo . “workflow”  Preparazione della libreria  emulsion PCR  sequenziamento mediante reazioni di ligazione

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Invece di fornire un gruppo ossidrile al 3 ’ per l ’ estensione mediata dalla DNA polimerasi, il “ primer ” e orientato in modo da fornire un gruppo fosfato al 5 ’ per consentire la ligazione a sonde durante il primo passaggio di sequenziamento mediante ligazione ( “ ligation sequencing ” ). Ogni sonda consiste in un ottamero costituito (in direzione 3 ’ →5 ’ ) da 2 basi specifiche seguite da 6 basi degenerate con uno dei 4 marcatori fluorescenti legato all ’ estremita 5 ’ . Le 2 basi specifiche corrispondono a una delle 16 possibili combinazioni di doppiette di basi (per es. TT, GT e cosi via). Nel primo passaggio di “ ligation sequencing ” sono presenti una ligasi termostabile e le sonde rappresentanti le 16 possibili combinazioni, che competono tra loro per l ’ ibridazione alla sequenza stampo immediatamente adiacente al “ primer ” . Dopo il legame delle sonde, viene effettuata una reazione di ligazione a cui segue una fase di lavaggio per eliminare le sonde non ibridate. I segnali di fluorescenza vengono rilevati e la porzione marcata delle sonde ligate viene tagliata e allontanata tramite un lavaggio in modo da rigenerare un gruppo fosfato all ’ estremità 5 ’ . Nei cicli successivi di sequenziamento, le sonde vengono ligate al gruppo fosfato all ’ estremita 5 ’ del pentamero precedente. Vengono effettuati 7 cicli di ligazione successivi, definiti come un “ round ” , per estendere il primo primer ” . Successivamente, il filamento sintetizzato viene denaturato e viene ibridato un nuovo “ primer ” di sequenziamento, sfasato di una base (n-1) rispetto al “ primer ” usato nel passaggio precedente. In totale sono realizzati 5 “ round ” , utilizzando ogni volta nuovi “ primer ” sfasati di basi successive (n-2, n-3 e cosi via), e questo tipo di approccio permette che ogni nucleotide del DNA stampo venga sequenziato due volte. Adattato da Metzker, 2010

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Mediante una seduta analitica della durata di 6 giorni sono generate “ reads ” di lunghezza pari a 35 bp, la cui composizione nucleotidica viene interpretata in base ai risultati ottenuti dalla ligazione delle diverse sonde con le 16 combinazioni possibili di doppiette di basi. Grazie all ’ utilizzo di “ primer ” sfasati, vengono sequenziate diverse basi dell ’ oligonucleotide adattatore. …in pratica… Questa informazione fornisce una sequenza di riferimento. Il “ capping ” dei filamenti non estesi associato all ’ uso di una ligasi ad alta fedeltà e alla doppia interrogazione di ogni base nucleotidica del DNA stampo durante cicli indipendenti di ligazione consentono, secondo il produttore, di ottenere una sequenza consenso ( “ consensus ” ) con un ’ accuratezza pari al 99,9% per un frammento noto di DNA stampo sequenziato in “ reads ” di lunghezza pari a 25 nucleotidi con un “ coverage ” di 15 volte.

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Ion Torrent Ion Torrent ™ Technology è in grado di tradurre direttamente, su un semiconduttore, le informazioni codificate chimicamente (A, C, G, T) in informazioni digitali (0, 1). Il risultato è una tecnologia di sequenziamento che è più semplice, più veloce e più conveniente di qualsiasi altra tecnologia disponibile e alla portata di qualsiasi laboratorio di ricerca o clinico. La tecnologia Ion torrent è basata sul fatto che in natura, quando un nucleotide è incorporato da una polimerasi in un filamento di DNA, uno ione idrogeno viene rilasciato come sottoprodotto . 10 Mb di sequenze di alta qualità in circa 2 ore “ loading port ”

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“workflow”  Preparazione della libreria  emulsion PCR  sequenziamento mediante rilevazione delle variazioni di pH dovute a rilascio di ioni H +

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…in pratica… …sequenzialmente flusseranno in continuo i 4 deossinucleotidi.. …e in seguito all ’ incorporazione verranno rilasciati ioni idrogeno (H +) Non si avrà rilascio se non avrà luogo l ’ incorporazione!! .in seguito all ’ incorporazione di due nucleotidi, si avrà il rilascio di due ioni H + …risultato? ..un ionogramma

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Method Ion semiconductor (Ion Torrent sequencing) Pyrosequencing (454) Sequencing by synthesis (Illumina) Sequencing by ligation ( SOLiD sequencing) Chain termination ( Sanger sequencing ) Read length up to 400 bp 700 bp 50 to 250 bp 50+35 or 50+50 bp 400 to 900 bp Accuracy 98% 99.9% 98% 99.9% 99.9% Reads per run up to 80 million 1 million up to 3 billion 1.2 to 1.4 billion N/A Time per run 2 hours 24 hours 1 to 10 days, depending upon sequencer and specified read length 1 to 2 weeks 20 minutes to 3 hours Cost per 1 million bases (in US$) $1 $10 $0.05 to $0.15 $0.13 $2400 Advantages Less expensive equipment . Fast. Long read size . Fast. Potential for high sequence yield, depending upon sequencer model and desired application. Low cost per base. Long individual reads. Useful for many applications. Disadvantages Homopolymer errors . Runs are expensive. Homopolymer errors. Equipment can be very expensive. Slower than other methods. Have issue sequencing palindromic sequence . More expensive and impractical for larger sequencing projects. Confronto fra le varie tecnologie NGS

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L’analisi dei risultati

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Sequenziamento mediante metodo di Sanger …semplificato… Next generation Sequencing …impossibile assemblare manualmente… …stessi dati..differenti parametri…

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..formati dei files e strumenti per la gestione dei dati prodotti dalla NGS… Adattato da Dolled-Filhart, 2013

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..un “workflow” tipico… sequenziamento SFF Seq Qual FastQ trasformazione SAM BWA/BWASW BAM SAM tools Samtools Pileup Pileup Filtering Samtools Pl & awk Pileup Samtools Pileup VCF GFF ..dalle sequenze alle varianti… Sequence Alignment / Map numero elevato di “ short reads ” Sequence Alignment / Map Variant Call Format General Feature Format  file di testo tab- delimitato che descrive le caratteristiche genomiche .

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Prototipo di analisi…paziente 1 Terminato il processo di sequenziamento, viene lanciato lo strumento ( “ plugins ” ) che permette di chiamare le varianti presenti nel campione analizzato. Le varianti chiamate sono analizzate facendo riferimento alla loro posizione cromosomica e mediante piattaforme come l ’ IGV (Integrative Genomics Viewer ).

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…viene visualizzata la variante e classificata. ..in questo caso si tratta di una del6 insAG

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Prototipo di analisi…paziente 4 Terminato il processo di sequenziamento, viene lanciato lo strumento ( “ plugins ” ) che permette di chiamare le varianti presenti nel campione analizzato. Le varianti chiamate sono analizzate facendo riferimento alla loro posizione cromosomica e mediante piattaforme come l ’ IGV (Integrative Genomics Viewer ).

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…viene visualizzata la variante e classificata. ..in questo caso si tratta di una insA

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Le applicazioni Nei 4 anni successivi alla messa in commercio della prima piattaforma, le tecnologie NGS hanno notevolmente accelerato la crescita di vari settori di ricerca genomica, consentendo di effettuare esperimenti che in precedenza non erano tecnicamente possibili o convenienti da un punto di vista economico.

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Risequenziamento genomico di regioni di interesse Il sequenziamento di sottoregioni genomiche e di gruppi di geni viene attualmente impiegato per identificare polimorfismi e mutazioni in geni implicati nei tumori e in regioni del genoma umano osservate avere un coinvolgimento in malattie genetiche , mediante studi di “ linkage ” e di associazione sull ’ intero genoma . 1. Sequenziamento dell’intero genoma (whole genome sequencing) “ de novo genome assembly ” ; Individuazione di varianti (mutazioni, SNPs, indels, variazioni del numero di copie). Analisi genomica La capacità di sequenziare interi genomi umani mediante piattaforme NGS ad un costo sostanzialmente ridotto ha dato nuovo impulso allo sviluppo di progetti internazionali volti a sequenziare migliaia di genomi umani nei prossimi dieci anni (http://www.1000genomes.org). 2. Targeted resequencing

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Sequenziamento del trascrittoma Le tecnologie NGS hanno fornito un nuovo e potente approccio, denominato “ RNA-Seq ” , per la mappatura e la quantificazione dei trascritti nei campioni biologici. RNA-Seq viene attualmente impiegato per confermare e aggiornare informazioni geniche, incluse le regioni alle estremita 5 ’ e 3 ’ , e le regioni di giunzione tra esoni e introni. Possono essere desunte sia informazioni di tipo qualitativo che di tipo quantitativo relative a fenomeni di “ splicing ” alternativo. Mappatura delle proteine leganti il DNA e analisi della cromatina La caratterizzazione delle proteine regolatrici associate al genoma e progredita enormemente grazie all ’ introduzione delle tecnologie di immunoprecipitazione della cromatina e all ’ ibridazione a “ microarray ” (ChIP-onchip). La tecnologia ChIP-on-chip è attualmente sostituita in una varietà di approcci sperimentali con ChIP-Seq, in cui il DNA recuperato dell ’ immunoprecipitato viene convertito in una libreria che viene analizzata mediante piattaforme NGS. 4. Chip-seq 3. Expression profiling RNA-seq-splicing variants Metagenomica Le tecnologie NGS hanno avuto un impatto enorme sullo studio della diversità microbica in campioni ambientali e clinici. Esempi di studi di metagenomica includono analisi di popolazioni microbiche nell ’ oceano e nel suolo, l ’ identificazione di un nuovo arenavirus in pazienti trapiantati e la caratterizzazione della microflora presente nella cavità orale umana e nell ’ intestino di gemelli obesi e magri. 5. Metagenomica

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BIBLIOGRAFIA Review Article Sequencing technologies - the next generation. Michael L. Metzker*‡. Nature RevIews Genetics 2010 Jan;11(1):31-46. Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Voelkerding KV, Dames SA, Durtschi JD. Clinical chemistry 2009 Apr;55(4):641-58. Next-generation DNA sequencing methods. Mardis ER. Annual review of genomics and human genetics 2008;9:387-402. Review Article Computational and Bioinformatics Frameworks for Next-Generation Whole Exome and Genome Sequencing Marisa P. Dolled-Filhart, Michael Lee Jr., Chih-wen Ou-yang, Rajini Rani Haraksingh, and Jimmy Cheng-Ho Li. The Scientific World Journal 2013;2013:730210.

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